Édition de gènes médiée par transposon PiggyBac dans les iPSC humaines : une procédure pour intégrer le gène d’intérêt dans les iPSC humaines à l’aide du système de transposon PiggyBac

Résumé

Source : Garone, M. G. et al. Conversion de cellules souches pluripotentes induites humaines (iPSC) en motoneurones spinaux et crâniens fonctionnels à l’aide de vecteurs PiggyBac. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre la procédure de génération de motoneurones par transfection d’iPSC humaines avec le système de transposon PiggyBac par l’expression ectopique de facteurs de transcription spécifiques à la lignée.

Protocole

1. Génération de lignées iPSC inductibles NIL et NIP

1. Transfection cellulaire
   1. Rincez les cellules avec du PBS (sans Ca²⁺/Mg²⁺).
   2. Ajouter le réactif de dissociation cellulaire (voir le tableau des matières) (0,35 mL pour une boîte de 35 mm) et incuber à 37 °C jusqu’à ce que les cellules individuelles soient
   3. séparé (5-10 min).
   4. Complétez en douceur la séparation des cellules en pipetant de haut en bas avec une pipette P1000 3 à 4 fois.
   5. Prélever dans un tube de 15 mL et ajouter du PBS (Ca^2+/Mg²⁺ libre) à 10 mL. Comptez les cellules.
   6. Granulez 10⁶ cellules et mettez-les en suspension dans 100 μl de tampon R (inclus dans le kit d’électroporation de cellules, voir tableau des matériaux).
   7. Ajouter de l’ADN plasmidique pour la transfection : 4,5 μg de vecteur transposable (epB-Bsd-TT-NIL ou epB-Bsd-TT-NIP) et 0,5 μg du plasmide transposase piggyBac.
   8. Transfecteur parfait avec le système d’électroporation de la cellule (voir tableau des matériaux) selon les instructions du fabricant avec les paramètres suivants : tension de 1 200 V, largeur de 30 ms, 1 impulsion. Ensemencez les cellules dans un milieu iPSC humain complété par 10 μM Y-27632 (inhibiteur de ROCK, voir le tableau des matériaux) dans une boîte enrobée de matrice de 6 mm.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
B27	Miltenyi Biotec	Tél. : 130-093-566	Supplément sans sérum pour l’entretien des cellules neuronales
Bambanker	Nippon Genetics	NGE-BB02	Milieu de congélation cellulaire pour progéniteurs de motoneurones
CaCl2	Sigma-Aldrich	Réf. C3881	Produits chimiques pour solutions électrophysiologiques
Matrice qualifiée hESC de Corning Matrigel	Corning	354277	Préparation de la membrane basale reconstituée à partir du sarcome de souris Engelbreth-Holm-Swarm (EHS). Utilisé pour l’adhérence de l’iPSC sur des supports en plastique et en verre
FLUIDE DE CONGÉLATION CRYOSTEM ACF	Industries biologiques	Référence 05-710-1F	Milieu de congélation pour iPSC humaines
Dispase	Gibco	Référence 17105-041	Réactif pour la dissociation en douceur des iPSC humaines
DMEM/F12	Sigma-Aldrich	D6421-500ML	Milieu basal pour la culture cellulaire
Doxycycline	Sigma-Aldrich	D9891-1G	Utilisé pour induire l’expression de transgènes à partir des vecteurs epB-BSD-TT-NIL et epB-Bsd-TT-NIP
DS2U	WiCell	UWWC1-DS2U	Ligne commerciale iPSC humaine
GDNF	PréproTech	450-10	Facteur neurotrophique dérivé de la glie
Ligne hiPSC épisomale Gibco	Thermo Fisher Scientific	A18945	Ligne commerciale iPSC humaine
Hepes	Sigma-Aldrich	N° H4034	Produits chimiques pour solutions électrophysiologiques
Laminine	Sigma-Aldrich	11243217001	Favorise l’attachement et la croissance des cellules neurales in vitro
NEAA	Thermo Fisher Scientific	11140035	Acides aminés non essentiels. Utilisé comme complément pour les milieux de culture cellulaire, pour augmenter la croissance et la viabilité cellulaires.
Kit néon 100 μL	Thermo Fisher Scientific	MPK10096	Kit d’électroporation de cellules
Système de transfection au néon	Thermo Fisher Scientific	MPK5000	Système d’électroporation de cellules
Milieu neurobasal	Thermo Fisher Scientific	21103049	Milieu basal conçu pour le maintien et la maturation à long terme des populations de cellules neuronales sans avoir besoin d’une couche nourricière d’astrocytes
NutriStem-XF/FF	Industries biologiques	Référence 05-100-1A	Milieu de culture iPSC humain
PBS Ca2+/Mg2+ gratuit	Sigma-Aldrich	D8537-500ML	Tampon salin phosphate Dulbecco's, sans calcium, sans magnésium
Pénicilline/streptomycine	Sigma-Aldrich	P4333-100ML	Solution de pénicilline/streptomicine utilisée pour prévenir la contamination des cultures cellulaires par des bactéries.
Y-27632 (inhibiteur de ROCK)	Enzo Sciences de la Vie	ALX-270-333-M005	Inhibiteur sélectif perméable aux cellules de la protéine kinase (ROCK) associée à Rho. Augmente la survie des iPSC