Chargement de billes pour introduire des acides nucléiques dans des cellules cultivées adhérentes : une technique pour charger des plasmides codant pour des protéines fluorescentes dans des cellules de mammifères adhérents

1. Cellules de chargement de billes

REMARQUE : Si nécessaire, laver brièvement les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis ajouter 2 mL du milieu optimal. Incuber pendant au moins 30 min.

1. Préparez une solution de 3 à 8 μL contenant les plasmides, les protéines et/ou les particules souhaités. Utiliser ~1 μg (0,1-1 pmol) de chaque type de plasmide et ~0,5 μg (0,01 nmol) de protéine, selon les exigences expérimentales. Utilisez un tube à faible rétention pour les protéines afin qu’elles ne soient pas laissées sur les parois du tube. Amener la solution à un minimum de 3 μL avec du PBS et ajuster le volume de la solution pour enrober toute la surface des cellules à charger (c.-à-d. le micropuits de la chambre, figure 1B).
2. Mélangez soigneusement la solution en pipetant de haut en bas et/ou en effleurant le tube. Faites tourner brièvement la solution jusqu’au fond du tube dans un microfuge de table.
3. Transférez la solution de chargement des billes et la chambre des cellules dans une hotte de culture tissulaire. Effectuez les étapes restantes dans le capot de culture tissulaire en utilisant une technique stérile.
4. Retirez le milieu des cellules et stockez-le temporairement dans un tube stérile. Aspirez doucement tout le fluide sur les bords de la chambre et inclinez la chambre à un angle d’environ 45° et retirez la goutte restante de support dans le micropuits central. Lors du retrait du fluide, assurez-vous d’éviter de laisser la pointe de la pipette toucher le verre, ce qui pourrait entraîner un pelage et une perte de cellules. Passez rapidement à l’étape suivante afin que les cellules ne restent pas sèches longtemps.
5. Pipetez doucement la solution de chargement des billes sur le micropuits en verre au centre de la chambre. En option : Incuber avec un balancement doux pendant ~30 s sans laisser la chambre sécher complètement.
6. Dispersez doucement une monocouche de billes de verre sur le dessus des cellules, de préférence à l’aide d’un appareil de chargement de billes (Figure 1A). Assurez-vous que les billes recouvrent complètement les cellules du micropuits à fond de verre.
7. En pinçant la chambre avec deux doigts, tapotez-la contre la surface de la hotte en la soulevant de ~2 pouces et en l’abaissant fermement. Utilisez une force à peu près équivalente à la chute de la parabole de cette hauteur. Répétez l’opération pour un total de ~10 taps.
   note: Assurez-vous que les tarauds ne décollent pas considérablement les cellules. Le taraudage peut être optimisé pour le type de cellule. Si les cellules se chargent mal, tapotez plus fort ; Cependant, si de nombreuses cellules se décollent, tapotez plus légèrement.
8. Rajoutez doucement le fluide dans la chambre en le pipetant lentement sur le côté en plastique de la chambre. Essayez d’aspirer les billes flottantes sans déranger les cellules. Ajoutez plus de support préchauffé à cette étape si vous en avez retiré trop. Incuber les cellules pendant 0,5 à 2 h dans l’incubateur.

Figure 1 : Appareil de chargement des billes, technique et chronologie