Chargement de billes pour introduire des acides nucléiques dans des cellules cultivées adhérentes : une technique pour charger des plasmides codant pour des protéines fluorescentes dans des cellules de mammifères adhérents

Résumé

Source : Cialek, C. A. et al. Chargement de protéines et d’acides nucléiques dans des cellules humaines adhérentes. J. Vis. Exp. (2021).

Dans cette vidéo, nous décrivons la procédure d’introduction des acides nucléiques dans des cellules de mammifères adhérents en utilisant le chargement en billes.

Protocole

1. Cellules de chargement de billes

REMARQUE : Si nécessaire, laver brièvement les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS), puis ajouter 2 mL du milieu optimal. Incuber pendant au moins 30 min.

1. Préparez une solution de 3 à 8 μL contenant les plasmides, les protéines et/ou les particules souhaités. Utiliser ~1 μg (0,1-1 pmol) de chaque type de plasmide et ~0,5 μg (0,01 nmol) de protéine, selon les exigences expérimentales. Utilisez un tube à faible rétention pour les protéines afin qu’elles ne soient pas laissées sur les parois du tube. Amener la solution à un minimum de 3 μL avec du PBS et ajuster le volume de la solution pour enrober toute la surface des cellules à charger (c.-à-d. le micropuits de la chambre, figure 1B).
2. Mélangez soigneusement la solution en pipetant de haut en bas et/ou en effleurant le tube. Faites tourner brièvement la solution jusqu’au fond du tube dans un microfuge de table.
3. Transférez la solution de chargement des billes et la chambre des cellules dans une hotte de culture tissulaire. Effectuez les étapes restantes dans le capot de culture tissulaire en utilisant une technique stérile.
4. Retirez le milieu des cellules et stockez-le temporairement dans un tube stérile. Aspirez doucement tout le fluide sur les bords de la chambre et inclinez la chambre à un angle d’environ 45° et retirez la goutte restante de support dans le micropuits central. Lors du retrait du fluide, assurez-vous d’éviter de laisser la pointe de la pipette toucher le verre, ce qui pourrait entraîner un pelage et une perte de cellules. Passez rapidement à l’étape suivante afin que les cellules ne restent pas sèches longtemps.
5. Pipetez doucement la solution de chargement des billes sur le micropuits en verre au centre de la chambre. En option : Incuber avec un balancement doux pendant ~30 s sans laisser la chambre sécher complètement.
6. Dispersez doucement une monocouche de billes de verre sur le dessus des cellules, de préférence à l’aide d’un appareil de chargement de billes (Figure 1A). Assurez-vous que les billes recouvrent complètement les cellules du micropuits à fond de verre.
7. En pinçant la chambre avec deux doigts, tapotez-la contre la surface de la hotte en la soulevant de ~2 pouces et en l’abaissant fermement. Utilisez une force à peu près équivalente à la chute de la parabole de cette hauteur. Répétez l’opération pour un total de ~10 taps.
   note: Assurez-vous que les tarauds ne décollent pas considérablement les cellules. Le taraudage peut être optimisé pour le type de cellule. Si les cellules se chargent mal, tapotez plus fort ; Cependant, si de nombreuses cellules se décollent, tapotez plus légèrement.
8. Rajoutez doucement le fluide dans la chambre en le pipetant lentement sur le côté en plastique de la chambre. Essayez d’aspirer les billes flottantes sans déranger les cellules. Ajoutez plus de support préchauffé à cette étape si vous en avez retiré trop. Incuber les cellules pendant 0,5 à 2 h dans l’incubateur.

Résultats

Figure 1 : Appareil de chargement des billes, technique et chronologie

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîtes de culture cellulaire de 10 cm	VWR	Référence 82050-916	Utilisation pour cultiver des cellules
Boîtes de culture cellulaire de 35 mm	Faucon	353001	Utilisation pour construire un chargeur de billes
Chambre cellulaire Attofluor	Thermo Fisher Scientific	A7816	Utilisation pour construire le chargeur de billes personnalisé
DMEM, glycémie élevée, sans glutamine	Thermo Fisher Scientific	11960069	Utilisation en culture cellulaire générale
Plats à fond en verre, 35 mm, #1.5, 14 mm en verre	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C	Ensemencement de cellules dans ces chambres pour l’imagerie
Perles de verre, lavées à l’acide, ≤106 μm	Millipore Sigma	Réf. G4649	Saupoudrer sur les cellules pour charger l’ADN plasmidique et les protéines
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	Thermo Fisher Scientific	AM9625	Stock de travail stérile 1X PBS
DMEM sans phénol	Thermo Fisher Scientific	31053036	Utilisation sur cellules avant l’imagerie
Opti-MEM, Sérum Réduit Moyen	Thermo Fisher Scientific	31985070	Milieu optimal pour l’incubation des cellules avant le chargement des billes (étape facultative)