Administration d’une cargaison d’acides nucléiques à l’aide de nanolames : une technique pour délivrer le complexe Cas9-sgRNA à des cellules cibles via des particules pseudo-virales

Résumé

Source : Mangeot, P. E., et al. Livraison du complexe ribonucléoprotéique Cas9/sgRNA dans des cellules immortalisées et primaires via des particules pseudo-virales (« nanoblades »). J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo présente une technique d’administration à l’aide de nanolames du complexe ribonucléoprotéique Cas9-sgRNA à l’intérieur de cellules cibles pour l’édition du génome. Les nanolames sont des particules pseudo-virales dépourvues de la capacité de se multiplier et d’infecter les cellules voisines, elles sont donc très utiles pour le transport rapide et dépendant de la dose de biomatériaux et de nanomatériaux.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Conception et clonage de l’ARNsg

REMARQUE : Les lignes directrices pour la conception des ARNsg peuvent être obtenues à partir de sources multiples telles que https://blog.addgene.org/how-to-design-your-grna-for-crispr-genome-editing ou auprès de Hanna et Doench.

1. Une fois que les 20 séquences d’ARNsg nucléotidiques ont été conçues, commandez les oligonucléotides d’ADN simple brin suivants :
   1. Vers l'avant : 5' caccgNNNNNNNNNNNNNNNNNN 3' (N correspond au locus ciblé sans la séquence du motif adjacent au protospacer (PAM))
   2. Inverse : 5' aaacNNNNNNNNNNNNNNNNc 3' (N correspond au complément inverse du locus ciblé sans la séquence PAM)
      note: Aucune modification particulière n'est nécessaire lors de la commande des oligonucléotides (pas besoin de phosphate 5').
2. Hybrider les deux oligonucléotides d’ADN dans un tube de réaction en chaîne par polymérase (PCR) de 0,2 mL en mélangeant 5 μL de tampon de recuit (500 mM de NaCl ; 100 mM de Tris-HCl ; 100 mM de MgCl2 ; 10 mM de DTT ; pH de 7,9 à 25 °C), 1 μL de chaque oligonucléotide d’ADN (solution mère de 100 μM dans l’eau) et 42 μL d’eau.
3. Sur un bloc de PCR, incuber les échantillons à 95 °C pendant 15 s, puis diminuer la température à 20 °C avec une rampe de 0,5 °C/s. Conserver à température ambiante ou conserver à -20 °C
   note: Le protocole peut être mis en pause ici.
4. Digérer 10 μg des plasmides d’expression de l’ARNsg BLADE ou SUPERBLADE avec 10 unités de l’enzyme de restriction BsmBI-v2 pendant 3 h à 55 °C dans un volume de réaction total de 50 μL.
   note: Le vecteur digéré doit libérer un insert d’ADN de ~1,9 kb et un second fragment d’ADN de ~3,3 kb.
5. Chargez la réaction de restriction sur un gel d’agarose à 1 % coloré avec 5 μg/mL de bromure d’éthidium (ou une autre coloration au gel d’ADN plus sûre).
   note: Porter un équipement de protection approprié lors de la manipulation du bromure d’éthidium, qui est soupçonné de causer des anomalies génétiques.
   1. Sur une table ultraviolette (UV) réglée à une longueur d’onde de 312 nm (pour éviter d’endommager l’ADN), coupez le fragment d’ADN de 3,3 kb du gel et placez-le dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml.
      REMARQUE : Portez un équipement de protection approprié (gants et lunettes de protection UV) lorsque vous manipulez du bromure d’éthidium et travaillez sur la table UV.
   2. Extrayez l’ADN du gel tranché contenant le fragment d’ADN de 3,3 kb à l’aide d’un kit d’extraction de gel d’ADN dédié (voir le tableau des matériaux). Quantifiez la quantité d’ADN purifié à l’aide d’un spectrophotomètre.
      REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.
6. Comparez les oligonucléotides d’ADN hybrides avant et inverse de l’étape 1.2 au vecteur BLADES ou SUPERBLADE digéré par BsmB1 et purifié en gel à l’étape 1.5.2. Pour cela, ajoutez 2 μL de tampon d’ADN ligase T4, 50 ng du vecteur purifié en gel (à partir de l’étape 1.5.2), 1 μL d’oligonucléotides d’ADN hybridés (à partir de l’étape 1.2), de l’eau pour compléter le volume à 19 μL et 1 μL d’ADN ligase T4. Incuber la réaction à 25 °C pendant 10 min.
   1. Transformer le produit de ligature en bactéries compétentes (voir la Table des matériaux). Placez les bactéries transformées sur une plaque de gélose à l’ampicilline Luria Bertani et incubez toute la nuit à 37 °C.
   2. Sélectionnez plusieurs colonies isolées sur la plaque de gélose pour effectuer une mini-préparation de l'ADN (voir la Table des matériaux), et effectuez le séquençage de Sanger à l'aide d'une amorce directe U6 (5' GACTATCATATGCTTACCGT 3') pour vérifier la ligature correcte de la séquence variable de l'ARNsg.
      REMARQUE : D’autres plasmides d’expression d’ARNsg peuvent être utilisés s’ils ne codent pas pour la protéine Cas9, ce qui pourrait interférer avec la production de Nanoblade.

2. Préparation du plasmide

1. Effectuer une maxipréparation (voir la Table des matières) de tous les plasmides requis et préparer des aliquotes de 10 μg à 1 μg/mL pour les conserver à -20 °C. Évitez les cycles répétés de congélation/décongélation des plasmides ; utilisez les aliquotes deux fois avant de les jeter.

3. Préparation de la nanolame

1. Le jour 1, ensemencer entre 3,5 et 4 × 10⁶ cellules HEK293T (voir le tableau des matières) dans 10 mL de milieu Eagle modifié de Dulbecco contenant du glucose élevé, du pyruvate de sodium, de la L-glutamine, 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et de la pénicilline/streptomycine dans une boîte de culture cellulaire de 10 cm. Déplacez doucement la plaque de 10 cm vers l’arrière et vers l’avant, puis de droite à gauche (répétez cette séquence 5 fois) pour répartir les cellules de manière homogène sur la boîte de culture. Incuber des cellules à 37 °C dans un incubateur cellulaire avec 5 % de CO₂.
   note: Toutes les procédures liées à la manipulation des cellules cultivées et des Nanoblades doivent être effectuées sous une hotte à flux laminaire de culture cellulaire pour éviter leur contamination.
2. Jour 2 : Transfection plasmidique
   1. Les cellules doivent être confluentes à 70-80 % 24 h après le placage (Figure 1A). Remplacez le milieu par 10 ml de DMEM frais contenant du glucose élevé, du pyruvate de sodium, de la L-glutamine, 10 % de FBS (la pénicilline et la streptomycine peuvent être omises bien que ce ne soit pas obligatoire) avant la transfection.
      REMARQUE : À cette étape, il est important que les cellules ne soient pas confluentes. Sinon, l’efficacité de la transfection ainsi que la production de particules pourraient être réduites.
   2. Pour chaque plaque de 10 cm, préparer les quantités suivantes de plasmides dans un tube de 1,5 mL : 0,3 μg de pCMV-VSV-G, 0,7 μg de pBaEVRless, 2,7 μg de MLV Gag/Pol, 1,7 μg de BIC-Gag-Cas9, 4,4 μg de plasmide BLADES ou SUPERBLADES codant pour l’ARNsg cloné (ou 2,2 μg chacun si l’on utilise deux ARNsg).
   3. Ajouter 500 μL de tampon de transfection (voir le tableau des matériaux), agiter le vortex pendant 10 s, puis centrifuger pendant 1 s. Ajouter 20 μL de réactif de transfection (voir le tableau des matériaux), agiter le tube pendant 1 s, puis centrifuger pendant 1 s.
   4. Incuber pendant 10 minutes à température ambiante et ajouter la solution entière goutte à goutte dans les cellules du milieu DMEM à l’aide d’une pipette P1000. Déplacez doucement la plaque de 10 cm d’avant en arrière, puis de droite à gauche (répétez cette séquence 5 fois) pour répartir uniformément le réactif de transfection sur les cellules. Incuber des cellules à 37 °C pendant au moins 40 h dans un incubateur cellulaire avec 5 % de CO₂,
      note: Si vous le souhaitez, le milieu peut être changé 4 h après la transfection.
3. Le jour 3, vérifiez la morphologie des cellules transfectées au microscope.
   note: Les cellules productrices commenceront à fusionner. Il s’agit d’un phénomène normal dû à l’expression d’enveloppes virales fusogènes (Figure 1B,C).
4. Jour 4 : Récolte des Nanoblades
   note: Au moins 40 h après la transfection, les cellules auraient fusionné en raison de l’expression des enveloppes virales fusogènes, et parfois, les cellules sont complètement détachées du support de la plaque (Figure 1D).
   1. Prélever 9 mL du surnageant du milieu de culture à l’aide d’une pipette de 10 mL.
      note: Les nanolames sont des VLP capables de délivrer la protéine Cas9 et son ARNsg associé dans les cellules primaires et in vivo. Bien qu’ils ne soient pas considérés comme des organismes génétiquement modifiés car ils sont dépourvus de matériel génétique, ils peuvent induire des changements génétiques. Par conséquent, ils doivent être manipulés avec prudence pour éviter tout contact avec les utilisateurs (surtout s’ils sont programmés pour cibler les gènes suppresseurs de tumeurs). Il est conseillé aux utilisateurs de suivre les directives de sécurité locales pour la manipulation des vecteurs rétroviraux et de travailler dans un laboratoire de niveau BSL-2 lors de la préparation des VLP et de la réalisation d’expériences de transduction. Les nanolames peuvent être inactivées avec 70 % d’éthanol ou 0,5 % d’hypochlorite de sodium. Il est également conseillé de traiter tous les déchets plastiques (pointes de pipettes, plaques de culture tissulaire, tubes de centrifugation) avec de l’hypochlorite de sodium à 0,5 % pendant au moins 10 min pour inactiver les Nanoblades.
   2. Centrifuger le surnageant collecté à 500 × g pendant 5 min pour éliminer les débris cellulaires et récupérer le surnageant sans perturber la pastille cellulaire.
      REMARQUE : Si les Nanoblades sont destinés à être utilisés sur des cellules primaires, filtrez le surnageant à l’aide d’un filtre de 0,45 μm ou de 0,8 μm. Sachez que cette étape réduit drastiquement le titre de Nanoblade car une fraction importante sera bloquée dans la membrane filtrante.
   3. Granulez les Nanopales pendant la nuit (12-16 h) dans un rotor à godets oscillants à 4 300 × g ou à 209 490 × g dans une ultracentrifugeuse pendant 75 min à 4 °C (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : Si les cellules cibles peuvent se développer dans le DMEM, il est possible de les incuber directement avec le surnageant obtenu après l’étape 3.4.2 sans concentrer les Nanoblades.
5. Jour 5 : Mise en suspension et stockage des nanolames
   1. Après la centrifugation, aspirez lentement le fluide et remettez en suspension la pastille blanche avec 100 μL de solution saline froide tamponnée au phosphate (PBS). Couvrir le tube d’un parafilm et incuber pendant 1 h à 4 °C en agitant doucement avant de remettre le granulé en suspension en le pipetant de haut en bas.
      note: Une matière visqueuse blanche peut apparaître lors de la remise en suspension ; Ceci est normal et n’affecte pas de manière significative l’efficacité de la transduction.
   2. Conservez les Nanoblades à 4 °C si vous prévoyez de les utiliser dans les quatre semaines. Sinon, congelez les Nanoblades dans de l’azote liquide et stockez-les à -80 °C.
      REMARQUE : Portez des lunettes de protection et des gants cryogéniques lors de la manipulation de l’azote liquide. La congélation et le stockage à -80 °C entraînent une diminution significative de l’efficacité de Nanoblade. De plus, les Nanoblades décongelés ne doivent pas être congelés à nouveau. Le protocole peut être mis en pause ici.

4. Concentration de nanolames sur un coussin de saccharose

REMARQUE : Comme alternative à la centrifugation de nuit ou à l’ultracentrifugation (étape 3.4.3), les Nanoblades peuvent être concentrées sur un coussin de saccharose. Cela donne une fraction plus pure de Nanoblades, bien que la quantité totale récupérée soit plus faible.

1. Préparez une solution de saccharose à 10 % (poids/volume) dans 1x PBS, et filtrez-la à travers un filtre à seringue de 0,2 μm (voir le tableau des matériaux).
2. Commencez le processus de concentration des Nanolames sur le coussin de saccharose.
   1. Placez 9 mL d’échantillon contenant du VLP (de l’étape 3.4.3) dans un tube d’ultracentrifugation (voir le Tableau des matières). À l’aide d’une seringue de 3 mL et d’une canule, superposer lentement 2,5 mL de saccharose à 10 % sous l’échantillon, en essayant de ne pas mélanger l’échantillon contenant du VLP et la solution de saccharose.
   2. Vous pouvez également placer 2,5 ml de saccharose à 10 % dans un tube à ultracentrifugeuse (voir le tableau des matériaux). Inclinez le tube et ajoutez lentement les 9 mL d’échantillon contenant du VLP (à l’étape 3.4.3) à l’aide d’un pipeteur à basse vitesse. Au cours de cette opération, soulevez progressivement le tube en position verticale.
3. Centrifuger les échantillons à 209 490 × g dans une ultracentrifugeuse pendant 90 min à 4 °C.
   note: Cette technique peut être adaptée pour une centrifugation à basse vitesse (4 300 × g) pendant la nuit.
4. Après la centrifugation, retirez soigneusement le surnageant et placez le tube à l’envers sur du papier de soie pour éliminer tout liquide restant. Après 1 min, ajoutez 100 μL de 1x PBS et placez le tube à 4 °C avec un couvercle en parafilm dans un porte-tube sur une table d’agitation pendant 1 h (voir le tableau des matériaux) avant de remettre le granulé en suspension par pipetage de haut en bas.
   REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici.

5. Surveillance de la charge Cas9 dans les Nanoblades par dot-blot

1. Préparez le tampon de dilution en ajoutant 1 volume de tampon de lyse contenant un tensioactif non ionique (voir le tableau des matériaux) dans 4 volumes de 1x PBS. Diluez 2 μL de Nanopales concentrés dans 50 μL de tampon de dilution, agitez brièvement et transférez 25 μL de ce mélange dans un nouveau tube contenant 25 μL de tampon de dilution. Répétez cette opération pour avoir 4 tubes de dilutions Nanoblade (2 étapes de dilution).
2. Pour les témoins standard, diluer 2 μL de nucléase Cas9 recombinante (voir le tableau des matériaux) dans 50 μL de tampon de dilution, agiter brièvement, puis procéder à huit dilutions en série (dilution 2 fois pour chaque étape).
3. Placez soigneusement 2,5 μL de chaque dilution VLP et 2,5 μL de chaque étalon sur une membrane de nitrocellulose à l’aide d’une pipette multicanaux (un volume plus important peut entraîner le chevauchement des taches).
   note: Une membrane en polyfluorure de vinyle traitée au méthanol peut également être utilisée.
4. Une fois que les particules sont absorbées par la membrane, bloquez la membrane avec 1x solution saline tamponnée au Tris contenant un tensioactif non ionique (TBS-T) complété par du lait écrémé en poudre (5 % p/v) pendant 45 min à température ambiante.
   note: Le protocole peut être mis en pause ici, et la membrane stockée à 4 °C dans 1x TBS-T.
5. Jetez le 1x TBST complété par du lait écrémé en poudre, et incubez la membrane pendant la nuit à 4 °C avec l’anticorps Cas9-raifort peroxydase (dilution 1/1000 dans 1x TBST, 5 % de lait). Lavez la membrane 3x avec du TBS-T et visualisez le signal à l’aide d’un kit de substrat chimiluminescent amélioré.
6. Quantifiez l’intensité du point pour les dilutions standard Nanoblades et Cas9 recombinantes à l’aide du logiciel propriétaire fourni avec la station d’imagerie sur gel ou imageJ. Définissez une courbe linéaire reliant l’intensité du point à la concentration Cas9. A l’aide de la fonction de la courbe obtenue, extrapoler la teneur en Cas9 de chaque préparation.
   note: La quantité de protéine témoin Cas9 recombinante peut saturer la lecture pour les échantillons les plus concentrés de l’ensemble de dilution standard (Figure 2). Il est donc conseillé, lors de la définition de la courbe linéaire, de retirer la lecture des échantillons non dilués (et parfois celle des premières étapes de dilution) s’ils ne sont pas dans la plage linéaire par rapport à la concentration connue de Cas9 qui a été repérée. De même, lors de l’extrapolation de la quantité de Cas9 dans les échantillons Nanoblade, n’utilisez que les lectures qui se trouvent dans la plage linéaire de la courbe standard.

6. Transduction de cellules cibles avec des nanolames (procédure de transduction dans une plaque à 12 puits)

1. Dans une plaque à 12 puits, ensemencer 100 000 à 200 000 cellules (cellules adhérentes primaires ou immortalisées) par puits dans 1 mL du milieu de culture cellulaire approprié. Laissez les cellules adhérer à la surface de la plaque avant la transduction.
2. Dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml, ajoutez 5 à 20 μL de Nanopales concentrés (à partir de l’étape 3.5.1 ou 4.4) à 500 μL de milieu de culture cellulaire, et mélangez en pipetant de haut en bas avec un pipeteur P1000. Retirez le milieu des cellules et remplacez-le par les 500 μL de ce mélange Nanoblade.
   note: La transduction doit être optimisée pour chaque type de cellule. Il est important d’utiliser le plus petit volume possible de milieu (tout en évitant le dessèchement des cellules cibles) afin que les Nanolames restent très concentrées. Les cellules adhérentes doivent être transduites directement lorsqu’elles sont fixées à la plaque (ne pas transduire, en suspension, car cela diminuerait considérablement l’efficacité de la transduction). Certaines cellules tolèrent une exposition prolongée aux Nanoblades (24-48 h) tandis que d’autres sont très sensibles et peuvent former de petites syncytia. Dans ce cas, les Nanoblades doivent être incubés avec des cellules uniquement pendant 4 à 6 h avant de remplacer le milieu. La spinoculation peut également améliorer la transduction des cellules cultivées en suspension. Les adjuvants tels que les polymères cationiques (voir le tableau des matériaux) peuvent également améliorer l’efficacité de la transduction dans certains types de cellules.
3. Après 4 à 6 h d’incubation cellulaire dans un faible volume de milieu contenant des Nanoblades, augmentez le volume du milieu à la quantité normale (1 mL si vous travaillez avec une plaque à 12 puits), ou remplacez-le par un milieu frais si les cellules sont sensibles aux VLPs.
   note: Le milieu cellulaire contenant des Nanoblades doit être inactivé avec de l’hypochlorite de sodium à 0,5 % pendant 10 minutes avant d’être jeté. Utilisez des gants et des lunettes de protection lorsque vous manipulez de l’hypochlorite de sodium. Si les nanolames induisent la mort cellulaire, adaptez la quantité et la durée totale de l’exposition pour réduire la mortalité cellulaire.

Résultats

Figure 1 : Morphologie des cellules productrices pendant la production de Nanoblade.(A) HEK293T cellules à 70-80 % de confluence 24 h après le placage. (B et C) HEK293T morphologie cellulaire 24 h après la transfection. (D) HEK293T morphologie cellulaire 40 h après la transfection. Barres d’échelle = 400 μm.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
13,2 ml, tubes en polypropylène à paroi mince, 14 x 89 mm - paquet de 50	Beckman Coulter Sciences de la vie	331372	Tubes d’ultracentrifugation pour la purification des Nanopales
Membranes de transfert Amersham Protran Premium Western, nitrocellulose	Merck	GE10600004	Membrane de nitrocellulose pour quantifier les niveaux de Cas9 dans des nanolames purifiées
BIC-Gag-CAS9	Addgene	119942	Encode une fusion GAG (F-MLV)-CAS9(sp). Permet la production de particules semblables au virus GAG-CAS9 à partir de cellules productrices en association avec des ARNg surexprimés et des enveloppes appropriées
BICstim-Gag-dCAS9-VPR	Addgene	120922	Code une fusion GAG-dCAS9-VPR pour une activation transcriptionnelle ciblée
lame	Addgene	134912	Squelette vide pour le clonage de séquences d’ARNsg à utiliser dans le système Nanoblades
BsmBI-v2	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	R0739S	Enzyme de restriction pour digérer les vecteurs BLADE et SUPERBLADES pour le clonage de l’ARNsg
Cas9 (7A9-3A3) Souris mAb (conjugué HRP) #97982	Technologie de signalisation cellulaire	Référence 97982S	Anticorps anti-Cas9 pour la quantification de Cas9 par dot-blot
Nucléase Cas9, S. pyogenes	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	M0386T	Protéine Cas9 recombinante à utiliser comme référence pour la quantification absolue de la quantité de Cas9 chargée dans les Nanoblades
Solution de bromure d’éthidium (10 mg/mL dans H2O)	Sigma-Aldrich	E1510-10ML	Pour colorer les gels d’agarose et visualiser l’ADN
Fisherbrand Agitateurs de mouvement d’ondes	Fisher Scientific	Tél. : 88-861-028	Table d’agitation pour remettre en suspension les Nanopales lors de la centrifugation
gelAnalyzer			http://www.gelanalyzer.com ; Quantifier l’intensité de la bande après digestion
Producteur de gesicle 293T	Takara	632617	Lignée cellulaire productrice de Nanoblades
Gibco DMEM, hyperglycémie, pyruvate	ThermoFisher Scientific	41966052	Milieu de culture cellulaire pour cellules Gesicle Producer 293T
Kit de réactifs de transfection jetPRIME pour l’ADN et l’ADN/siRNA	Polyplus	Réf. POL114-15	Réactif de transfection pour la production de Nanoblade dans les cellules Gesicle Producer 293T
Millex-AA, 0,80 μm, filtre à seringue	Millipore	SLAA033SS	Filtre à seringue pour éliminer les débris cellulaires avant la concentration des nanolames
Millex-GS, 0,22 μm, filtre à seringue	Millipore	SLGS033SS	Filtre à seringue pour stériliser la solution de coussin de saccharose
Millex-HP, 0,45 μm, polyéthersulfone, filtre seringue	Millipore	SLHP033RS	Filtre à seringue pour éliminer les débris cellulaires avant la concentration de Nanoblades
Kit d’extraction de gel d’ADN Monarch	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	T1020L	Kit d’extraction de gel d’ADN pour la purification du fragment plasmidique pBLADES ou pSUPERBLADES lors de la digestion avec BsmBI
NEB E. coli stable et compétent (haute efficacité)	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	Réf. C3040I	Bactéries compétentes pour la transformation et l’amplification des plasmides
Kit NucleoBond Xtra Midi pour l’ADN plasmidique de qualité transfection	Macherey-Nagel	Référence 740410.5	Maxikit de préparation pour la purification de l’ADN plasmidique à partir de bactéries cultivées
Kit d’extraction d’ADNg Nucleospin	Macherey-Nagel	Référence 740952.5	Extraction d’ADN génomique à partir de cellules transduites
NucleoSpin Plasmide, Mini kit pour l’ADN plasmidique	Macherey-Nagel	Référence 740588.5	Minikit de préparation pour la purification de l’ADN plasmidique à partir de bactéries cultivées
NucleoSpin Tissue, Mini kit pour l’ADN des cellules et des tissus	Macherey-Nagel	Référence 740952.5	Kit d’extraction d’ADN génomique
Optima XE-90	Beckman Coulter Sciences de la vie	N° A94471	Ultracentrifuge
sans pBaEVRless	Els Verhoeyen (Inserm U1111)	Les demandes personnelles doivent être adressées à : els.verhoyen@ens-lyon.fr	Glycoprotéine Rless du rétrovirus endogène du babouin décrite dans Girard-Gagnepain, A. et al. Les LV pseudotypés de l’enveloppe du babouin surpassent les VSV-G-LV pour le transfert de gènes dans les CSH stimulées par les cytokines et au repos. Sang 124, 1221–1231 (2014)
pBS-CMV-gagpol	Addgene	Référence 35614	Enocdes les gènes gag et pol du virus de la leucémie murine
pCMV-VSV-G	Addgene	Référence 8454	Protéine d’enveloppe pour la production de particules rétrovirales lentivirales et MuLV
Saline tamponnée au phosphate (PBS)	ThermoFisher Scientific	14200091	10X PBS à diluer dans de l’eau milliporeuse
Réactif de transfection en polybrène	Millipore Sigma	TR-1003-G	Polymère cationique qui améliore l’efficacité de la transduction rétrovirale dans des cellules de mammifères spécifiques. Il peut également permettre l’entrée dépendante du virus d’un oligodésoxynucléotide (ODN) pour une réparation dirigée par homologie
Saccharose, pour la biologie moléculaire, ≥99,5 % (GC)	Sigma-Aldrich	S0389-5KG	Saccharose pour préparer un coussin pour la purification de Nanoblade par ultracentrifugation
SUPERBLADE5	Addgene	134913	Squelette vide pour le clonage de séquences d’ARNsg à utiliser dans le système de nanolames (Optimisé pour une efficacité accrue de l’édition du génome via Chen B et al., 2013)
Substrat SuperSignal West Dura à durée prolongée	ThermoFisher Scientific	Référence 34076	Substrat HRP à chimiluminescence améliorée (ECL) pour les taches de points Cas9
SW 41 Ti Rotor à godet oscillant	Beckman Coulter Sciences de la vie	331362	Rotor pour l’ultracentrifugation
SYBR Teinture de gel d’ADN sans danger	ThermoFisher Scientific	Réf. S33102	Alternative au bromure d’éthidium pour colorer les gels d’agarose et visualiser l’ADN
T4 ADN ligase	Biolabs de la Nouvelle-Angleterre	M0202S	ADN ligase pour ligaturer les vecteurs BLADE ou SUPERBLADES avec les oligos d’ADN duplex correspondant à la région variable de l’ARNsg
Tampon de lyse contenant du triton	Promega	E291A	Tampon de lyse pour perturber les nanolames et permettre la quantification de Cas9
DOUZE 20	Sigma-Aldrich	Réf. P9416	Pour la préparation du TBST