Microinjection d’embryons de moustiques : une technique pour délivrer de l’ADN exogène dans le jaune d’embryon d’Anopheles gambiae afin de générer des mutations germinales

Résumé

Source : Carballar-Lejarazú, R. et al, Méthode de micro-injection pour les embryons d’Anopheles gambiae. J. Vis. Exp. (2021).

Dans cette vidéo, nous démontrons l’administration de la construction du forçage génétique dans l’embryon du moustique Anopheles gambiae grâce à la technique de micro-injection embryonnaire. Cette procédure permet d’intégrer la construction de l’ADN livrée, par recombinaison homologue, dans les cellules germinales pour générer une population de moustiques transformée.

Protocole

1. Microinjection d’embryons

1. À l’aide d’une pointe de microchargeur, remplissez les aiguilles avec 2 μL de mélange d’ADN (ADN plasmidique à une concentration de 300 à 400 ng/μL. Insérez l’aiguille dans le porte-aiguille et connectez le tube de la pompe à pression automatisée (Figure 1).
2. Important : Alignez l’aiguille de manière à ce qu’elle fasse un angle de 15° avec le plan de la glissière (Figure 1).
3. Ouvrez la pointe de l’aiguille en touchant délicatement le premier œuf du moustique Anopheles gambiae et injectez-la en insérant la pointe de l’aiguille ≤ 10 μm dans le pôle postérieur. Une injection réussie entraînera un petit mouvement du cytoplasme à l’intérieur de l’ovule.
4. Utilisez les commandes de la platine coaxiale du microscope pour passer à l’œuf suivant afin de poursuivre l’injection.
   1. Pour vous assurer que la pointe de l’aiguille reste ouverte et ne s’est pas bouchée, appuyez sur le bouton Injecter avant d’entrer dans un autre embryon et visualisez la petite gouttelette à l’ouverture de l’aiguille.
   2. Si l’aiguille se bouche, appuyez sur le bouton Effacer pour dégager l’aiguille et répétez le test de visualisation des gouttelettes. Ajustez la pression au besoin si l’ouverture de la pointe de l’aiguille s’agrandit légèrement pour vous assurer que la taille de la gouttelette reste petite.
   3. Injectez ~40-50 œufs avec une aiguille.
      note: Assurez-vous que le papier filtre reste humide à tout moment. Gardez une contre-pression suffisante sur l’aiguille pour la garder dégagée. Une aiguille qui ne peut pas être débouchée doit être remplacée par une aiguille neuve. Le placement de l’embryon, l’insertion de l’aiguille et l’injection sont facilités par des microscopes dotés de commandes coaxiales pour le mouvement horizontal de la platine (Figure 2).
5. Une fois les injections terminées, rincer les œufs dans un récipient en verre recouvert de papier filtre et rempli de 50 mL de H2O désionisé (figure 3).
   note: Les embryons commenceront à éclore 2 jours après l’injection et peuvent prendre jusqu’à 3 à 5 jours. Les larves du premier stade écloses doivent être transférées immédiatement (vérifier 2 fois par jour) dans un récipient propre contenant de l’eau et de la nourriture.

Résultats

Figure 1 : Position de l’aiguille lors des micro-injections. A) Vue grand angle de l’étage d’injection. B,C) Positionnez l’aiguille de manière à ce que les embryons alignés forment un angle de 15° avec l’aiguille d’injection. N’élevez pas le bras de l’instrument de micro-injection qui maintient l’aiguille beaucoup plus haut que la platine du microscope pour assurer une bonne i...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
10x tampon de micro-injection	-	-	1 mM de tampon NaHPO4, pH 6,8, 50 mM KCl
Membrane buvard (Zeta-Probe GT Genomic Tested Blot)	Bio-Rad		Coupé net et droit en morceaux de 2x1 cm
Eau désionisée ou doublement distillée (ddH20)	Mili-Q		Dans un flacon toilette
Microscope de dissection	Leica	Leica MZ12	Pour l’alignement de l’embryon
Récipient en verre	Pyrex	Réf. 3140	125 x 65
Toboggan en verre	Marque Fisher	No : 12-549-3	75 x 26 millimètre
Micro-injecteur	Instrument Sutter		Micro-injecteur numérique XenoWorks
Microchargeur Pointes de pipette	Eppendorf		Microchargeur 20 μL EPT.I.P.S.
Micromanipulateur	Instrument Sutter		Micromanipulateur XenoWorks
Micropipette	Rainin		20 μL
microscope	Leica	DM 1000 LED ou M165 FC	Pour la micro-injection
Maille en nylon
Pinceau	Blick	Réf. 05831-7040	Fin, taille 4/0
Pétri			Plastique, (60x15 mm, 90x15 mm)