Administration hydrodynamique de gènes : une technique de transfection in vivo d’ADN exogène dans des hépatocytes murins par injection dans la veine caudale

Résumé

Source : Hubner, E. K. et al., Systèmes constitutifs et inductibles pour la modification génétique in vivo des hépatocytes de souris à l’aide de l’injection hydrodynamique de la veine de queue. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo décrit la technique de transfection génétique in vivo d’hépatocytes murins par injection hydrodynamique de la veine caudale. Ce système de transfection génère une expression à long terme du transgène dans les hépatocytes.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation de la solution pour l’injection hydrodynamique de la veine terminale

REMARQUE : Préparez les constructions plasmidiques pour l’expression génique constitutive et inductible par la technique de clonage utilisant des bactéries compétentes.

1. Préparez une solution saline stérile à 0,9 % pour injection (ne pas utiliser de PBS). Utilisez un volume correspondant à environ 10 % du poids du corps de la souris. Exemple : pour une souris de 20 g, préparer 2 mL de solution.
2. Préparez des vecteurs d’injection qui ont été purifiés à l’aide d’un kit de purification de plasmides sans endotoxines.
3. Ajouter 10 μg ou 15 μg de vecteur de la belle au bois dormant sans endotoxines (utiliser 10 μg, à partir de l’étape 4, utiliser 15 μg, respectivement) et 1 μg de pc-HSB5 sans endotoxines par mL de solution saline stérile.
4. Conserver la solution jusqu’à 4 h à 4 °C. Ne pas congeler.

2. Réalisation de l’injection hydrodynamique de la veine de queue

1. Utiliser un dispositif de contention pour l’injection dans la veine de la queue (commercial ou préparé à partir d’un tube conique de 50 mL avec des trous pour la respiration et pour la queue). Remplissez le fond du tube avec du papier de soie.
2. Pour l’injection, utilisez des souris d’environ 8 à 10 semaines avec un poids de 20 à 25 g.
3. Pesez les souris avant l’injection et préparez le volume d’injection en fonction du poids corporel (correspondant à 10 % du poids corporel). Préparez une seringue stérile de 3 ml avec une aiguille de 27 G pour l’injection et remplissez-la avec le volume requis.
4. Placez la souris dans le dispositif de contention. Ajustez la quantité de papier de soie pour ne laisser qu’un minimum d’espace pour le mouvement, mais suffisamment d’espace pour respirer.
5. Assurez-vous que la souris respire régulièrement.
6. Réchauffez la queue à l’aide d’une lampe infrarouge pendant 30 à 60 secondes. Surveillez attentivement les signes de surchauffe.
7. Nettoyez la queue avec un tampon imbibé d’alcool.
8. Insérez l’aiguille presque horizontalement dans l’une des deux nervures latérales de la queue près de la base de la queue.
   note: S’il est placé avec succès, une petite quantité de sang peut refluer dans le cône de l’aiguille. Il n’est pas recommandé d’aspirer activement car tout mouvement supplémentaire de l’aiguille peut entraîner son déplacement et/ou des lésions de la veine.
9. Injectez le volume total dans la veine de la queue en 8 à 10 s.
10. Retirez immédiatement la souris de la retenue. Compressez la plaie d’injection pendant au moins 30 secondes ou jusqu’à ce que tout saignement disparaisse.
11. Placez la souris dans une cage séparée. Une fois que la souris s’est rétablie de la procédure (environ 30 à 60 minutes), transférez-la dans sa cage d’origine. Vérifiez régulièrement sur la souris les prochaines 24 h.
    note: Une légère sédation de la souris est systématiquement observée jusqu’à 2 heures après l’injection.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
NaCl 0,9 %	Braun	3200905	Support pour injections intraveineuses
Tube conique Falcon 50ml	Corning Sciences de la vie	352095
Lampe infrarouge	n/a	n/a	Pour réchauffer la queue de souris
Plasmides pour le clonage de vecteurs transposons de la belle au bois dormant pour HTVI.
Le	n/a		Vecteur d’expression génique constitutive
pEN_TTmcs	Addgene	Réf. 25755	Vecteur d’entrée pour l’expression génique inductible
pEN_TTGmiRc2	Addgene	Réf. 25753	Vecteur d’entrée pour l’expression inductible de miRshRNA avec coexpression de GFP
pEN_TTmiRc2	Addgene	Réf. 25752	Vecteur d’entrée pour l’expression inductible de miRshRNA sans coexpression de GFP
pTC ApoE-Tet	Addgene	Réf. 85578	Vecteur d’expression pour l’expression d’un gène inductible ou d’un miR-shRNA avec le promoteur ApoE.HCR.hAAT
pTC-CMV-Têt	Addgene	Réf. 85577	Vecteur d’expression pour l’expression d’un gène inductible ou d’un miR-shRNA avec promoteur de CMV