Transformation génétique médiée par Agrobacterium : une méthode pour transformer génétiquement le génome du riz via Agrobacterium tumefaciens génétiquement modifié

Résumé

Source : Xu, D., et al. Transformation génétique médiée par Agrobacterium, production transgénique et son application pour l’étude du développement reproductif mâle chez le riz. J. Vis. Exp. (2020).

Dans cette vidéo, nous démontrons la transformation génétique du génome du riz à l’aide d’un vecteur binaire Agrobacterium tumefaciens. Cette bactérie facilite le transfert d’un plasmide d’ADN étranger à l’aide des protéines de virulence d’Agrobacterium.

Protocole

1. Transformation génétique du riz et culture de tissus végétaux

1. Induction et régénération des callosités
   note: Utilisez des inflorescences de riz jeunes et fraîches comme matière première pour induire des callosités (figure 1).
   1. Récoltez les jeunes inflorescences dans la rizière ou la serre au stade de la méiose, déterminée par une longueur de fleuron de 1,6 à 4,8 mm (figure 1A). Assurez-vous que les inflorescences de riz sont recouvertes d’une gaine foliaire. Essuyez chaque inflorescence avec un tampon d’alcool à 70 % et laissez-la sécher avant de la couper.
   2. Apportez l’inflorescence sur un banc stérile propre. Coupez-le en petits morceaux (plus c’est petit, mieux c’est) avec des ciseaux stérilisés, puis transférez les boutures sur une plaque de Pétri contenant du milieu NBD2 (figure 1B, tableau 1).
   3. Incuber la plaque dans l’obscurité à 26 °C pendant environ 10 à 14 jours pour induire des callosités (Figure 2A).
      note: Utilisez directement le cal nouvellement formé pour l’infiltration d’Agrobacterium (étape 1.2.7) ou reconditionnez-le une fois de plus dans un milieu NBD2 frais pour obtenir plus de callosités. Transférez la callosité dans le nouveau milieu NBD2 tous les 8 à 10 jours.
2. Transformation et co-culture
   1. Utiliser la bactérie A. tumefaciens contenant le plasmide binaire avec la construction sgRNA-CAS9 pour la transformation. Conserver les souches d’A. tumefaciens dans un milieu YEB (tableau 1) avec 50 % de glycérol à -80 °C pour une utilisation ultérieure.
   2. Passer A. tumefaciens d’un stock de glycérol à -80 °C à un milieu gélosé YEB contenant des antibiotiques sélectifs (tableau 1) et croître à 25–28 °C pendant 48–72 h, pour permettre l’apparition des colonies.
   3. Inoculer une seule colonie de la plaque YEB avec des antibiotiques sélectifs à 5 mL de milieu liquide YEB contenant les mêmes antibiotiques sélectifs (tableau 1), dans un tube à essai stérile conique de 50 mL. Agiter sur un agitateur orbital à 250 x g, à 25-28 °C jusqu’à ce que les bactéries atteignent une DO₆₀₀ de 0,5.
   4. Ajouter 1 mL de suspension bactérienne à 100 mL de milieu YEB (tableau 1) avec les mêmes antibiotiques sélectifs dans une fiole conique de 250 mL et agiter sur un agitateur orbitaire à 250 x g, à 28 °C pendant 4 h.
   5. Centrifuger à 4 000 x g pendant 10 min à température ambiante pour recueillir les bactéries. Jetez le surnageant.
   6. Remettre la pastille bactérienne en suspension avec le milieu AAM-AS (tableau 1) et diluer la suspension à une DO_{de 600} = 0,4.
      note: Le diamètre extérieur parfait de la suspension bactérienne est essentiel pour une transformation efficace. Il aide à éliminer la croissance bactérienne excessive sur le durillon.
   7. Prélever environ 150 cals embryogènes sains et fragiles de couleur jaune clair à l’étape 1.1.3 dans une fiole stérile de 150 ml. Ajouter 50 à 75 ml de suspension de cellules bactériennes de l’étape 1.2.6 dans le ballon stérile, puis ajouter environ 10 à 25 ml de milieu AAM-AS frais pour immerger les cals pendant 10 à 20 minutes, en secouant de temps en temps.
   8. Versez soigneusement la suspension bactérienne du flacon et séchez l’excès de suspension bactérienne du cal à l’aide de papier filtre stérile #1 ou de papier de soie. Placez-les ensuite sur une boîte de Pétri avec un milieu NBD-AS (Tableau 1) recouverte d’un papier filtre stérile #1. Incuber à 25–28 °C dans l’obscurité pendant 3 jours et vérifier s’il n’y a pas de prolifération bactérienne.
3. Sélection pour les callosités résistantes
   1. Après 3 jours de co-culture, transférez les calli dans une boîte de Pétri stérile avec un papier filtre stérile.
   2. Faites sécher les calli à l’air libre pendant 2 h sur un banc propre. Assurez-vous que la callosité n’adhère pas au papier filtre.
   3. Transvaser uniformément les cals à l’aide d’une pince à épiler stérile dans le milieu de sélection primaire NBD2 (avec 40 mg/L d’hygromycine et 250 mg/L de timentine) (tableau 1). Cultivez les calli pendant 2 semaines à 25–28 °C dans l’obscurité.
   4. Après 2 semaines, transvaser uniformément les cals dans une nouvelle assiette contenant du milieu de sélection frais NBD2 (avec 40 mg/L d’hygromycine et 250 mg/L de timentine) (Tableau 1). Cultivez les cals pendant encore 2 semaines à 25–28 °C dans l’obscurité.
4. Différenciation des callosités
   1. Transférer les callosités dans un milieu MS frais (avec 25 mg/L d’hygromycine et 150 mg/L de timentine) (tableau 1). Culture à la lumière à 25–28 °C pendant environ 2 semaines.
   2. Répétez l’étape 1.4.1 une fois de plus.
   3. Transférez les bourgeons dans le nouveau milieu MS (avec 10 mg/L d’hygromycine) pour faire proliférer plus de pousses.

Tableau 1 : Compositions de milieux pour la transformation du riz. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Résultats

Graphique 1 : Matériaux de départ pour induire des callosités. (A) Jeunes inflorescences de riz au stade de méiose. (B) Jeunes inflorescences disséquées poussant sur le milieu NBD2. Barre = 2 cm po (A).

Graphique 2 : Procédé de production...