Administration de gènes in vitro médiée par électroporation : une technique d’impulsion électrique pour introduire des plasmides codant pour des protéines rapporteures fluorescentes dans des cellules en culture

Résumé

Source : Lo, J. C. W. et al., Méthode d’électroporation efficace et rentable pour étudier les voies de signalisation primaires dépendantes du cil dans le précurseur de la cellule granulaire.J. Vis. Exp.(2021)

Cette vidéo présente la technique d’électroporation qui introduit de l’ADN plasmidique codant pour des protéines fluorescentes dans des précurseurs de cellules granulaires cérébelleuses primaires de souris.

Protocole

1. Électroporation pour la surexpression du transgène du récepteur Hh : pEGFP-Smo

1. Pour l’électroporation à l’aide d’une cuvette à 2 mm d’espace, préparer le mélange d’électroporation plasmidique-cellule suivant pour chaque réaction d’électroporation : 1,2 ×^{10 6} cellules précurseurs de cellules précurseurs de granules cérébelleux primaires de souris et 10 μg de pEGFP-mSmo (ajuster la concentration du stock d’ADN à ~2-5 μg/μL dans un tampon Tris-EDTA ou un dH₂O stérile) dans 100 μL d’Opti-MEM.
   note: Réduisez le nombre total de cellules si les cellules sont insuffisantes (bien que cela puisse réduire l’efficacité de l’électroporation). Cependant, n’ajustez pas la quantité de plasmide ni le volume total d’Opti-MEM utilisé par cuvette. Si le nombre total de cellules requis pour l’expérience dépasse 1,5 × 10⁶ cellules, augmentez la quantité du mélange d’électroporation en conséquence et effectuez plusieurs réactions d’électroporation séparément. La cuvette peut être réutilisée jusqu’à 5 fois.
2. Préparez la plaque d’ensemencement de la cellule post-électroporation en ajoutant 0,5 mL de milieu de culture dans chaque puits de la plaque de culture à 24 puits contenant des lamelles enrobées et maintenez-la au chaud à 37 °C dans un incubateur de CO₂. Pour préparer les lamelles à la fixation des cellules, incuber des lamelles en verre de 12 mm autoclavées avec 100 μg/mL de poly-D-lysine (PDL, 1 mg/mL dans un dH₂O stérile) pendant au moins 1 h à 37 °C. Conserver les lamelles dans la même solution de PDL à 4 °C jusqu’à l’utilisation.
3. Pipeter le nombre requis de cellules dans un tube de microcentrifugation stérile de 1,5 mL et faire tourner à 200 × g pendant 5 min à RT. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule dans 200 μL d’Opti-MEM. Répétez cette étape deux fois avec Opti-MEM pour vous assurer qu’aucun milieu de culture résiduel n’est présent dans le tube.
   note: Pour chaque puits/lamelle d’une plaque de 24 puits, l’électroporat et la graine 1,2-1,3 × 10⁶ cellules/puits pour obtenir une confluence cellulaire de ~70-75 % le jour suivant de la culture.
4. Réglez les paramètres d’électroporation comme indiqué dans le tableau 1.
5. Pipetez doucement la réaction d’électroporation pour bien mélanger et utilisez une longue pointe P200 pour transférer un volume exact de 100 μL du mélange dans la cuvette de 2 mm d’espace. Évitez de former des bulles.
6. Placez la cuvette dans la chambre de la cuvette.
7. Appuyez sur le bouton Ω de l’électroporateur (voir le tableau des matériaux) et notez la valeur d’impédance, qui doit être de ~30-35. Pour que la valeur d’impédance électrique Ω se situe dans la plage de 30 à 35, respectez un volume précis de 100 μL.
8. Appuyez sur le bouton de démarrage pour lancer l’impulsion.
9. Enregistrez les valeurs du courant et des joules mesurés affichées sur le cadre de lecture.
10. Retirez la cuvette de la chambre de la cuvette.
11. Ajoutez immédiatement 100 μL de milieu de culture préchauffé dans la cuvette et remettez-le en suspension en le pipetant doucement de haut en bas 2 à 3 fois. Transférez immédiatement la suspension de la cellule sur la plaque à 24 puits contenant les lamelles revêtues préparée à l’étape 1.2.
    note: Pour minimiser la mort cellulaire, ensemencez les cellules immédiatement après l’électroporation.
12. Incuber les cellules à 37 °C dans un incubateur de_CO2. Laissez les cellules intactes pendant 3 h pour éviter le détachement des cellules.
13. 3 h après l’ensemencement, aspirer doucement et jeter la moitié du milieu surnageant pour éliminer les cellules mortes et les débris flottants et le remplacer par la même quantité de milieu de culture préchauffé.
14. Incuber les cellules à 37 °C dans l’incubateur de CO₂.

	Réglage de l’impulsion de poring		Réglage de l’impulsion de transfert
	Points de contrôle au sol principaux de la souris	Neurones primaires	Points de contrôle au sol principaux de la souris	Neurones primaires
tension	275 V	275 V	20 V	20 V
longueur	1 ms	0,5 ms	50 ms	50 ms
intervalle	50 ms	50 ms	50 ms	50 ms
Non.	deux	deux	5	5
Taux D	10 %	10 %	40 %	40 %
polarité	+	+	±	±

Tableau 1 : Les paramètres d’électroporation des GCP primaires de souris et des neurones primaires à l’aide du Super Electroporator NEPA21 TYPE

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Supplément B27	Life Technologies LTD	17504044
GlutamMAXTM-I ,100x	Gibco, Technologies du Vivant	35050061	Substitut de L-glutamine
Matrigel	BD Biosciences	354277	Matrice de membrane basale
Neurobasale	Gibco, Technologies du Vivant	21103049
Bromhydrate de poly-D-lysine	Sigma Aldrich	P6407
Chambre de cuvette CU 500	Nepagene	CU500
Cuvette d’électroporation EPA (espace de 2 mm)	Nepagene	EC-002
Opti-MEM	Life Technologies LTD	31985070	Sérum réduit pour la transfection
pEGFP-mSmo	Addgene	Référence 25395
Super électroporateur NEPA21 TYPE II Électroporation in vitro et in vivo	Nepagene	NEPA21	Électroporateur