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1. Nucléofection de mérozoïtes ou de sporozoïtes
- Préparation avant la nucléofection des parasites
- Préparez environ 10à 7 mérozoïtes ou sporozoïtes dans un tube. Si vous transfectez des mérozoïtes, préparez 3-4 tubes.
- Préparez une quantité d’ADN plasmidique ou de fragment de PCR purifié supérieure ou égale à 10 μg.
note: Le plasmide utilisé dans cette étude contient 2 gènes : la protéine fluorescente jaune améliorée (EYFP) et la dihydrofolate réductase thymidylate synthase dérivée de Toxoplasma gondii (TgDHFR-TS).
- Préparez 25 U d’enzyme de restriction. Si les plasmides sont linéarisés, l’enzyme de restriction peut améliorer l’efficacité de la transfection. Si les plasmides sont circulaires, omettez l’enzyme de restriction.
- Préparez 85 μL de tampon de nucléofection (tableau 1) : mélangez 20 μL de tampon de nucléofection I et 1 mL de tampon de nucléofection II et utilisez une partie de la solution. Le volume total du tampon est de 100 μL.
- Nucléofection
- Centrifuger le sporozoïte ou la suspension de mérozoïte à 600 x g pendant 10 min. Jetez ensuite le surnageant.
- Dans l’ordre suivant, ajoutez 85 μL de tampon de transfection nucléaire, 10 μg de plasmide (fragment de PCR) et 25 μL d’enzyme de restriction (généralement 5 μL) dans le tube de 1,5 ml contenant des sporozoïtes ou des mérozoïtes.
- Transférez la suspension dans une coupelle de transfection nucléaire. Insérez la coupelle dans une rainure de transfert nucléaire.
- Allumez le dispositif de nucléofection à l’aide du bouton d’alimentation et sélectionnez la procédure de transfection U-033. Si le dispositif de connexion démarre en mode Choix de programme libre, quittez ce mode en appuyant sur la touche X.
- Lorsque le programme se termine, appuyez sur le bouton X de l’appareil de nucléoflexion et l’écran devrait afficher OK, indiquant que la nucléofection est réussie.
- Ajoutez 0,5 à 1 ml de milieu d'aigle modifié (DMEM) de Dulbecco dans la coupelle de nucléofection pour arrêter la réaction et transférez la suspension dans un tube de 1,5 ml après avoir mélangé doucement.
| tampon
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composition
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| Tampon de nucléofection I | ATP-disodique 2g, MgCl2-6H 2O 1,2g, 10 ml d’eau |
| Tampon de nucléofection II | KH2PO4 6 g, NaHCO3 0,6 g, glucose 0,2 g, 500 ml d’eau |
| *eau : eau distillée | |
Table 1 : Composition des tampons.