Administration assistée par laser de gènes lentiviraux : une technique de perméabilisation d’ovules fécondés de souris pour faciliter l’administration de gènes lentiviraux

Résumé

Source : Martin, N. P., et al. Livraison de gènes lentiviraux assistée par laser à des œufs fécondés de souris. J. Vis. Exp. (2018).

Dans cette vidéo, nous démontrons la perméation assistée par laser de la couche protectrice de la zone pellucide dans des œufs fécondés de souris pour faciliter l’administration du gène lentiviral. Le lentivirus permet de générer des animaux transgéniques avec un gène d’intérêt intégré de manière stable dans leur génome.

Protocole

1. Perforation d’œufs fécondés de souris avec le laser XYClone

1. Configurez et calibrez le laser XYClone selon les recommandations du fabricant. D’autres lasers, généralement utilisés pour la fécondation in vitro, peuvent être substitués au laser XYClone pour perforer les ovules fécondés.
   1. Fixez le fil du boîtier du contrôleur laser à l’appareil laser du microscope.
   2. Fixez le boîtier du contrôleur laser à l’ordinateur exécutant le logiciel laser via un port USB. 3.1.3. Branchez le contrôleur laser et allumez-le.
   3. En regardant à travers l’oculaire, perforez un échantillon de test (par exemple, des marques effaçables à sec sur une lame de verre).
   4. À l’aide d’un petit tournevis (inclus dans le kit laser), ajustez les positions X et Y du laser pour qu’elles correspondent à la lumière LED visible à travers l’oculaire du microscope et calibrez le laser.
2. Placez une plaque de chute KSOM contenant des œufs de souris fécondés sur la platine du microscope. Ne pas garder la plaque à l’extérieur de l’incubateur pendant plus de 15 min.
3. Regardez à travers l'oculaire du microscope et assurez-vous que la zone pellucide de l'embryon est nette et que la lumière LED laser est visible.
4. Déplacez la platine du microscope pour cibler la zone avec la lumière LED/laser.
5. À l’aide du logiciel de l’ordinateur, réglez le laser XYClone sur 250 μs.
6. Ajustez la taille de la lumière LED aux dimensions souhaitées (réglage 5 dans cette expérience).
7. Perforez trois fois la zone de chaque œuf fécondé avec le laser. La zone peut être percée ou amincie. En utilisant les paramètres ci-dessus, le laser produira un trou d’un diamètre de 10 μm (Figure 1).
   note: Viser près du corps polaire éloigne le laser de la cellule embryonnaire.
8. Laissez les ovules fécondés récupérer pendant 2 h dans l’incubateur de culture tissulaire avant de passer à l’étape suivante.

2. Transduction d’ovules fécondés de souris suite à une perforation au laser XYClone

1. Pipeter 2 μL de lentivirus concentré (supérieur à 1e8 UT/titre mL) dans la goutte KSOM de 50 μL. Ne faites pas de pipette de haut en bas. Les œufs fécondés se fixent facilement à l’extrémité de la pipette. D’après notre expérience, la transmission d’unités 1e5-5e5 de lentivirus dans un volume inférieur à 3 μL est optimale pour l’administration de gènes.
2. Laissez les œufs fécondés se transformer en blastocyste pendant 4 jours dans l’incubateur. Pas besoin de changer de support.

3. Transfert non chirurgical d’embryons de souris transduits à des souris pseudo-enceintes

1. Utilisez des souris pseudo-enceintes, 3,5 jours après l’accouplement.
2. Utilisez un dispositif de transfert non chirurgical d’embryons (NSET) pour implanter des embryons de souris dans des souris pseudo-enceintes.
   1. À l’aide d’un microscope chirurgical ou de dissection, insérez un spéculum vaginal pour visualiser le col de l’utérus.
   2. Insérez le dispositif de transfert non chirurgical d’embryons (NSET) à environ 5 mm dans le col de l’utérus et déposez les embryons dans un volume d’environ 2 μL.
      note: Un dispositif NSET stérile est utilisé pour chaque transfert et jeté après la procédure. Tous les réactifs utilisés dans la manipulation des embryons doivent être stériles.
3. Transférez 10 à 15 blastocystes sains dans un volume de 2 μL de KSOM à chaque souris pseudo-enceinte.
4. Continuer à surveiller et à mesurer la prise de poids chez les souris pseudogravides dans les jours suivants pour déterminer si le NSET a été efficace.
5. Récupérez les chiots en laissant les souris gestantes accoucher naturellement ou en pratiquant une césarienne 17 jours après le transfert d’embryons. Une césarienne est souvent nécessaire si très peu d’embryons sont présents et qu’ils deviennent trop gros pour un accouchement naturel.
6. Prélever des tissus de chiots pour le génotypage afin de déterminer le taux de transgénèse.

Résultats

Graphique 1 : Traitement au laser des œufs fécondés de souris. Exemples de perforation de la zone pour produire un trou vs amincissement de la zone.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Plasmide CD510B-1	Biosciences des systèmes	CD510B-1 (en anglais)	utilisé pour emballer le lentivirus exprimant EF1a-copGFP
Diméthylpolysiloxane	sigma	DMPS5X	Culture d’embryons
Laser XYClone	Hamilton Thorne Biosciences		perforation d’oeufs de souris fécondés
Dispositif de transfert non chirurgical d’embryons (NSET)	ParaTechs	Référence 60010	NSET d’embryons
KSOM moyen	Millipore	MR-020P-5F	Culture d’embryons
Composition de KSOM :			mg/100 ml
NaCl			555
Kcl			18,5
KH2PO4			4,75
MgSO4 7H2O			4,95
CaCl2 2H2O			25
NaHCO3			210
glucose			3.6
Na-Pyruvate			2.2
DL-Acide lactique, sel de sodium			0,174 ml
10 mM d’EDTA			100μL
streptomycine			5
pénicilline			6.3
0,5 % de rouge phénol			0,1 ml
L-Glutamine			14,6
Acides aminés essentiels MEM			1 ml
MEM AA non essentiel			0,5 ml
Bsa			100