Transfert de gènes à médiation biolistique : technique permettant d’administrer un gène d’intérêt dans des cellules cibles via un pistolet à gènes biolistiques

Résumé

Source : Taylor, T., et al. Transformation biolistique d’un gène marqué fluorescent en l’agent pathogène fongique opportuniste Cryptococcus neoformans. J. Vis. Exp. (2015).

Dans cette vidéo, nous démontrons le protocole de livraison de gènes médiée par un pistolet de gène biolistique dans des cellules en culture. Cette méthode fournit une méthode simple de transformation génétique stable utilisant une quantité minimale d’ADN.

Protocole

1. Préparation de l’ADN

1. Préparez des disques biologiques macroporteurs orange en les immergeant dans de l’éthanol à 100 % à l’aide d’une pince. Placez les disques dans une grande boîte de Pétri contenant de la dirérite pour les faire sécher (assurez-vous que la diérite ne touche pas les disques).
2. Une fois secs, pressez les disques macroporteurs dans les supports de disques argentés (préalablement essuyés avec de l’éthanol à 100 %).
3. Des microbilles de support en or vortex sont suspendues dans de l’éthanol à 100 % et une aliquote de 12 μl dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml, à raison d’un tube par transformation.
4. Ajouter dans chaque tube dans l’ordre : 2 μg d’ADN (de préférence 2 μl de 1 μg/μl d’ADN), 10 μl de CaCl₂ 2,5 M et 2 μl de base libre de spermidine 1 M.
5. Mettez en place un contrôle négatif comme à l’étape 1.4, mais sans ADN.
6. Agitez chaque tube et incubez à température ambiante pendant 5 min. Agitez doucement chaque tube de temps en temps pour remettre en suspension les billes déposées pendant cette incubation.
7. Faites tourner les tubes à 225 x g pendant 30 secondes pour granuler les perles d’or recouvertes d’ADN. Retirer délicatement le surnageant (par pipetage ou aspiration) et le jeter.
8. Remettez complètement les billes en suspension dans 600 μl d’éthanol à 100 % en les pipetant lentement de haut en bas.
9. Essorez les tubes à 225 x g pendant 30 sec pour granuler les billes sans les tasser. Retirez et jetez soigneusement le surnageant.
10. Remettez en suspension les billes d’or recouvertes d’ADN dans 8 μl d’éthanol à 100 % en pipetant lentement de haut en bas.
11. Pipetez les billes d’or recouvertes d’ADN au centre du disque biologique sur un diamètre de 1 cm et laissez sécher.
    note: Un cercle d’or séché visible au centre du disque biologique indique qu’une concentration suffisante de billes d’or est présente.
    note: Les disques macroporteurs chargés de perles d’or recouvertes d’ADN sont maintenant prêts à être utilisés avec le pistolet à gènes.

2. Utilisation du pistolet à gènes

1. Allumez la pompe à vide.
2. Allumez l’hélium gazeux en tournant le bouton dans le sens inverse des aiguilles d’une montre jusqu’à ce qu’une pression d’environ 2 200 psi soit atteinte sur le manomètre.
3. Allumez le pistolet à gènes en actionnant l’interrupteur rouge sur la gauche.
4. Assurez-vous que les débits de l’aspirateur et de l’évent sont ajustés de sorte que le vide atteigne 28 pouces Hg en 15 secondes.
5. Assurez-vous que la distance entre le disque de rupture et le macrosupport est d’environ 3/8 de pouce.
6. Nettoyez toute la chambre en essuyant avec de l’éthanol.
7. Immergez les disques de rupture dans 100 % d’éthanol. Laisser sécher sur une surface stérile (par exemple, une boîte de Pétri).
8. À l’aide d’une clé dynamométrique, desserrez le support du disque de rupture. Insérez un disque de rupture propre dans le support. Revissez le support de disque de rupture et serrez à l’aide d’une clé dynamométrique en le tournant une fois vers la droite.
   note: Les disques de rupture seront remplacés après chaque tournage.
9. Immergez les tamis à mailles dans 100 % d’éthanol. Laisser sécher sur une surface stérile (par exemple, une boîte de Pétri).
10. Une fois sec, placez un tamis à mailles lavées sur la plaque de montage en plastique blanc. Placez le support de disque macrocarrier côté ADN vers le bas dans la chambre du disque. Vissez le capuchon argenté et placez la plaque de montage dans la fente la plus haute.
    note: L’écran grillagé sera remplacé après chaque prise de vue.
11. Placer une plaque de gélose YPD contenant 1 M de sorbitol sur la plaque inférieure.
12. Fermez la porte de la chambre et verrouillez-la en place.
13. Poussez et maintenez l’interrupteur rouge du milieu vers le haut pour engager le vide et permettre à l’aspirateur d’atteindre 28 pouces Hg. Une fois que le niveau de vide approprié est atteint, placez cet interrupteur en position basse. Lorsque vous êtes prêt, maintenez enfoncé l’interrupteur rouge sur la droite pour tirer. Lorsque le disque de rupture éclate, relâchez immédiatement le bouton d’incendie et poussez l’interrupteur rouge du milieu en position médiane pour ventiler la chambre à 0 psi.
14. Nettoyez les débris du disque de rupture et éteignez le pistolet à gènes. Ensuite, éteignez l’hélium gazeux en tournant le bouton dans le sens des aiguilles d’une montre, et enfin, éteignez la pompe à vide.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Perles d’or de 0,6 μm	Bio-Rad	165-2262	http://www.bio-rad.com
Base sans spermadine	Sigma- Aldrich	S0266	https://www.sigmaaldrich.com
Disques de rupture 1350 psi	Bio-Rad	165-2330	http://www.bio-rad.com
Arrêt des écrans	Bio-Rad	Référence 165-2336	http://www.bio-rad.com
Disques macro-transporteurs	Bio-Rad	Tél. : 165-2335	http://www.bio-rad.com
Système PDS-1000/He	Bio-Rad	Référence 165-2257	http://www.bio-rad.com
Centrifugeuse Microfuge 18	Beckman Coulter	F241.5P	www.beckmancoulter.com