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1. Revêtement de vaisselle en poly-ornithine/laminine (Po/L)
REMARQUE : Les volumes sont adaptés pour revêtir une plaque de 24 puits.
- Si nécessaire, placez une lamelle stérile de 12 mm dans le puits.
- Enduire les puits de 500 μL de solution de poly-L-Ornithine de 10 μg/mL dissoute dans l’eau.
- Laissez les puits se déposer à température ambiante pendant 1 h.
- Retirer la solution de Poly-L-Ornithine et laisser sécher à l’air libre pendant 30 min.
- Enduire les puits pendant la nuit à 37 °C avec 500 μL de laminine de 3 μg/mL dans du bicarbonate L-15.
note: Les puits peuvent être conservés à 37 °C pendant 7 jours dans l’incubateur. Pour les longues incubations, l’ajout de PBS stérile entre les puits peut aider à éviter l’évaporation du milieu.
2. Culture de motoneurones
- Diluer les MN à la densité appropriée, généralement de 5 000 à 10 000 cellules dans 500 μL de milieu de culture par puits dans une plaque de 24 puits.
note: La densité d’ensemencement est d’environ 30 000 et 1 500 cellules pour les plaques à 6 et 96 puits, respectivement.
- Retirez la solution de laminine avec un P1000.
- Transférez immédiatement les MN dilués dans le milieu de culture dans les plaques d’enrobage pour éviter le dessèchement.
- Incuber la culture pendant 2 jours à 37 °C.
3. Magnétofection des motoneurones
REMARQUE : Dans les étapes suivantes, les quantités utilisées sont destinées à la transfection d’un puits d’une plaque de 24 puits. Veuillez vous référer au protocole du fabricant pour un autre format.
- Pour la préparation de l’ADN, remettre en suspension 1 μg d’ADN dans 50 μL de milieu de culture neuronal et agiter pendant 5 s. Ici, des plasmides de 9 kb avec un promoteur CAGGS (pCAGEN) contrôlant l’ADNc du neurofilament sont utilisés.
- Pour la préparation du tube de billes, remettre en suspension 1,5 μL de billes dans 50 μL de milieu de culture neuronal.
- Ajouter la solution de billes de 50 μL à la solution d’ADN de 50 μL et incuber pendant 20 minutes à température ambiante (volume total = 100 μL).
- Au cours de cette incubation, prélever 100 μL de milieu de culture du puits qui sera transfecté.
REMARQUE : Placez la plaque magnétique dans l’incubateur pour la réchauffer à 37 °C.
- Transférez 100 μL du mélange ADN/billes dans le puits et incubez la plaque pendant 20 à 30 minutes sur la plaque magnétique à 37 °C.