1. Préparer la construction rétrovirale
- Sous-clonez les chaînes alpha et bêta du récepteur des lymphocytes T (TCR), séparées par un agent de liaison 2A, dans un vecteur rétroviral basé sur le MSCV (par exemple, pMIAII ou pMIGII).
note: L’éditeur de liens 2A permet l’expression stœchiométrique et concordante des chaînes TCR alpha et bêta à partir d’un seul cadre de lecture ouvert. Le vecteur comprend une cassette de protéines fluorescentes IRES (amétrine ou GFP) qui est utilisée pour suivre les cellules transduites et l’efficacité de la transduction.
- Isolez l’ADN plasmidique à l’aide d’un kit de préparation de plasma obtenu commercialement ou d’un produit similaire. Utilisez une concentration de travail de 1-2 μg μl-1.
2. Génération de lignées cellulaires productrices de rétroviraux
- Utilisez un processus en deux étapes pour produire les lignées cellulaires productrices de rétroviraux.
- Générer un rétrovirus par transfection transitoire de cellules 293T avec trois plasmides (pVSVG, pEQ-Pam3(-E) et vecteur d’intérêt) et prélever le surnageant rétroviral des cellules 293T pour transduire la lignée cellulaire productrice de rétroviraux écotropes GP+E86.
- Isoler les 40 % supérieurs des cellules productrices GP+E86 exprimant la fluorescence par FACS et propager les cellules productrices GP+E86 transduites comme source du virus.
note: La génération de producteurs de titres élevés est essentielle pour la transduction efficace des cellules de la moelle osseuse.
3. Transfert de gènes de cellules souches médié par le rétrovirus (Jour -5)
- Décongeler et cultiver 0,5 -1,0 x 106 de chaque lignée cellulaire productrice GP+E86 dans du DMEM 10 % (vol/vol) FBS complet pour permettre une croissance suffisante pour deux plaques confluentes de 150 mm d’ici le jour 0 de ce protocole.
note: La décongélation de 0,5 à 1,0 x 106 de chaque lignée cellulaire productrice de GP+E86 dans une plaque de 10 cm permettra une confluence de 30 à 50 % au jour 5. Cela permet également de mettre en culture 5 jours afin d’étendre les lignées cellulaires productrices de GP+E86 à deux plaques confluentes de 150 mm d’ici le jour 0.
- Culture d’une lignée cellulaire productrice rétrovirale dans un milieu de culture tissulaire complet contenant 5 % de sérum de veau fœtal et de ciprofloxacine (10 μg/ml) pour éviter la contamination par les mycoplasmes.
note: Cesser l’utilisation de la ciprofloxacine lors de la génération du surnageant viral pour la transduction de la moelle osseuse. Évitez la prolifération de la lignée cellulaire productrice, car cela aura un impact négatif sur l’efficacité de la transduction de la moelle osseuse.
4. Culture de cellules productrices rétrovirales (Jour 0)
- Plaque 3 x 106 cellules productrices rétrovirales par plaque de 150 mm dans 18 ml de DMEM complet à 20 % (vol/vol) FBS.
- Incuber des cellules productrices rétrovirales à 37 °C pendant la nuit. Prévoyez une plaque de 150 mm pour 15 millions de cellules de moelle osseuse (environ 2 à 3 souris donneuses).
5. Surnageant rétroviral (Jour 1)
- Le lendemain (environ 24 heures plus tard), prélever le surnageant rétroviral à partir des plaques productrices (configurées à l’étape 4) en prélevant le surnageant rétroviral directement sur la plaque de 150 mm à l’aide d’une seringue de 10 ml et filtrer à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 μm.
- Remplacer soigneusement le surnageant rétroviral éliminé par 18 ml de DMEM complet frais à 20 % (vol/vol) FBS.
- Compléter le surnageant rétroviral filtré avec de l’IL-3 (20 g ml-1), de l’IL-6 (50 g ml-1), du MSCF (50 g ml-1) et du bromure d’hexadiméthrine (Polybrene) (6 μg ml-1).
note: Le bromure d’hexadiméthrine doit être renouvelé tous les 2 mois pour éviter une baisse d’efficacité de la transduction rétrovirale.
6. Surnageant rétroviral et transduction (Jour 2)
- Après 24 heures, prélever le surnageant viral frais de la lignée cellulaire productrice virale. Filtrez le surnageant rétroviral à l’aide d’une seringue de 10 ml et d’un filtre de seringue de 0,45 m. Compléter le surnageant rétroviral filtré avec de l’IL-3 (20 g ml-1), de l’IL-6 (50 g ml-1) et du SCF (50 g ml-1), ainsi que du bromure d’hexadiméthrine (6 g ml-1).
- Ensuite, prélevez avec précaution à l’aide d’une pipette ou aspirez les 2 ml supérieurs de milieu de chaque puits de la plaque à six puits contenant les cellules de la moelle osseuse.
note: Travaillez soigneusement pour ne pas aspirer la moelle osseuse, qui est généralement concentrée au milieu du puits. Alternativement, le surnageant retiré peut être filé vers le bas pour récupérer les cellules perdues de la moelle osseuse.
- Dans chaque puits de la moelle osseuse, ajoutez 3 ml de surnageant viral frais contenant des cytokines et du bromure d’hexadiméthrine. Enveloppez les plaques dans du plastique et répétez la transduction de spin à 1 000 x g pendant 60 min à 37 °C. Déballez les plaques et incubez les cellules à 37 °C et 5 % de CO2 pendant la nuit (environ 24 heures).
7. Ajout de DMEM frais supplémenté (Jour 3)
- Après 24 heures, retirer les 2 ml supérieurs de milieu de chaque puits de la plaque à six puits contenant les cellules de la moelle osseuse, comme à l’étape 6.2. Remplacer le milieu retiré par du DMEM frais à 20 % (vol/vol) FBS complété par des concentrations finales d’IL-3 (20 g ml-1), d’IL-6 (50 g ml-1) et de SCF (50 g ml-1).
- Incuber les plaques de moelle osseuse à 37 °C dans un incubateur de CO2 pendant encore 24 heures.
