Coloration au rouge d’huile O : une technique de coloration des lipides neutres dans les hépatocytes pour détecter la stéatose hépatique in vitro

Résumé

Source : Campos-Espinosa, A. et al., A Model of Experimental Steatosis In Vitro : Hepatocyte Cell Culture in Lipid Overload-Conditioning Medium. J. Vis. Exp. (2021)

Dans cette vidéo, nous démontrons la coloration in vitro de lipides neutres dans les hépatocytes pour détecter une stéatose hépatique ou une accumulation excessive de graisse dans le foie. L’excès de graisse s’accumule dans les cellules sous forme de gouttelettes lipidiques. Oil Red O est un colorant liposoluble qui se lie aux lipides neutres intracellulaires dans ces gouttelettes lipidiques. Lorsqu’elles sont observées au microscope optique, ces gouttelettes lipidiques intracellulaires apparaissent intensément de couleur rouge.

Protocole

1. Coloration lipidique avec Oil-Red O

1. Placez une lamelle de culture cellulaire dans chaque puits d’une plaque de 24 puits.
2. Ensemencez 100 000 cellules HepG2 par puits. Ajouter 1 ml de RPMI 1640 standard.
3. Pré-incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 24 h.
4. Remplacez le milieu standard RPMI 1640 par le milieu stéatogène.
5. Incuber pendant 24 h, 2 jours, 3 jours et 4 jours, en rafraîchissant le milieu stéatogène toutes les 24 h.
6. Après le temps approprié, jetez le surnageant.
7. Laver avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Jetez le surnageant.
8. Fixer avec 1 mL de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS.
9. Incuber 1 h à température ambiante.
10. Jetez l’excès de paraformaldéhyde.
11. Rincez les cellules avec 1 mL d’eau distillée.
12. Ajouter 1 mL d’isopropanol à 70 % et laisser incuber pendant 5 min.
13. Jetez l’excès d’isopropanol. Un lavage PBS n’est pas nécessaire à ce stade.
14. Ajouter 1 mL de solution Oil-red O et incuber pendant 30 min.
15. Jetez l’excédent de solution O rouge huile.
16. Rincer à 1 mL d’eau distillée.
17. Ajouter 500 μL de solution d’hématoxyline. Incuber pendant 3 min.
18. Jetez l’excès de solution d’hématoxyline.
19. Rincer à 1 mL d’eau distillée.
20. Observez au microscope à un grossissement de 400x (Objectif 40x, Oculaire 10x).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Milieux de culture RPMI 1640	ThermoFisher-Gibco, États-Unis	Référence 31800-022	-
Sérum fœtal bovin (FBS)	ThermoFisher-Gibco, États-Unis	A4766801	-
Lignée cellulaire HepG2	ATCC, États-Unis	Réf. HB-8065	Carcinome hépatocellulaire cellules humaines.
Incubateur humidifié	Thermo Electronic Corporation, États-Unis	Modèle : 3110	Température (37 °C ± 1 °C), humidité (90 % ± 5 %) , CO2 (5 % ± 1 %)
Microscope inversé Eclipse	NIKON, JPN	Modèle : TE2000-S	-
Isopropanol	Sigma-Aldrich, États-Unis	I9030-4L	-
Kit O rouge huile	Abcam, États-Unis	AB150678	Kit pour la visualisation histologique de la graisse neutre.
paraformaldéhyde	Sigma-Aldrich, États-Unis	P6148-500G	-
Pénicilline/streptomycine	ThermoFisher-Gibco, États-Unis	Référence 15140-122	Antibiotiques 10 000 μg/ml de pénicilline, 10 000 μg/ml de streptomycine
Solution saline tamponnée au phosphate	ThermoFisher-Gibco, États-Unis	Référence 10010-023	-
Pipettes sérologiques	Sarstedt, Australie	Référence 86.1253.001	Non pyrogène, stérile, 5 mL
Pipettes sérologiques	Sarstedt, Australie	Référence 86.1254.001	Non apyrogène, stérile, 10 mL
Bicarbonate de sodium	Sigma-Aldrich, États-Unis	S5761-1KG	Préparation des milieux de culture
Oléate de sodium	Santa Cruz Biotechnology, États-Unis	sc-215879A	-
Palmitate de sodium	Santa Cruz Biotechnology, États-Unis	SC-215881	-
Trypsine 0,05 % /EDTA 0,53 mM	Corning, États-Unis	Référence 25-052-CL	-
Grappe de culture cellulaire de 24 puits	Corning, États-Unis	Référence 3524	Fond plat avec couvercle. Culture tissulaire traitée. Non apyrogène, polystyrène, stérile. 1/paquet.