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1. Quantification fluorométrique de lipides neutres à l’aide du rouge du Nil
REMARQUE : Seulement 10 μl d’une suspension d’algues à 5 g/L sont nécessaires pour la lecture de fluorescence. En général, l’isolement de la biomasse d’algues sèches à partir de 1,5 ml de bouillon de culture est plus que suffisant. De plus, l’intensité lumineuse de la lampe dans le spectrophotomètre peut se dégrader avec le temps. Il est recommandé d’inclure des étalons dans chaque expérience afin de s’assurer que les variations de l’instrument n’ajoutent pas d’erreurs inutiles aux mesures.
- Préparez une solution de rouge du Nil à une concentration de 10 μg/ml dissoute dans de l’éthanol de qualité réactif alcoolique. Conservez cette solution dans l’obscurité à 4 °C.
- Préparer une solution d’éthanol à 30 % (v/v) dans de l’eau désionisée et la conserver à 4 °C.
- Préparez tous les échantillons d’algues à la même concentration de biomasse (5 g/L est recommandé) et de la même manière que les étalons utilisés pour la mesure. Pour ce faire, suspendez les échantillons préséchés dans la quantité appropriée de tampon phosphate (0,6 g/L de phosphate de potassium dibasique, 1,4 g/L de phosphate de potassium monobasique), ou ajustez la concentration d’une culture d’algues en croissance à 5 g/L avec un tampon de phosphate après avoir mesuré la turbidité.
REMARQUE : Les mesures effectuées sur des cultures d’algues vivantes sont souvent associées à une erreur plus importante en fonction de la précision de la courbe d’étalonnage de la turbidité. La remise en suspension d’échantillons séchés peut nécessiter l’utilisation d’un homogénéisateur pour disperser complètement la biomasse.
- Pour chaque échantillon, mélangez 80 μl de la solution d’éthanol à 30 %, 10 μl de la solution de rouge du Nil et 10 μl de suspension d’algues dans un seul puits d’une plaque de 96 puits. Afin de bien tenir compte de la variabilité de la mesure de fluorescence, effectuez 5 répétitions de chaque échantillon.
- Exécutez une courbe d’étalonnage en deux points avec des étalons afin de tenir compte des variations quotidiennes de l’instrument et de la préparation. Préparez les étalons pour la mesure de la fluorescence en utilisant la même procédure que les échantillons.
REMARQUE : Généralement, deux points sont suffisants pour le réétalonnage de l’instrument, trois points peuvent être exécutés pour vérifier la linéarité.
- Effectuez les mesures de fluorescence dans un spectrophotomètre à lecteur de plaques multi-puits. Les conditions suivantes ont donné les résultats les plus cohérents :
- Agiter à 1 200 tr/min, orbite 3 mm, pendant 30 sec.
- Incuber à 40 °C pendant 10 min.
- Agiter à 1 200 tr/min, orbite 3 mm, pendant 30 sec.
- Fluorescence record, excitation à 530 nm, émission à 604 nm.
- Convertissez les mesures de fluorescence en teneur en huile à l’aide des résultats des étalons internes.