Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Préparation des réactifs
- Isolement et calcification des VSMC aortiques murins
- Solution de digestion aortique :
- Préparez une solution fraîche (~3-5 ml par aorte récoltée) avec la solution saline équilibrée de Hank's (HBSS) contenant 175 U/ml de collagénase de type 2 et 1,25 U/ml d'élastase. Stérilisez la solution à l’aide d’un système de filtration sous vide de 0,22 μm et maintenez la solution sur de la glace jusqu’à l’utilisation.
- Milieux cellulaires :
- Supplémenter 500 ml de Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) avec 10 % de sérum de bovin fœtal, 100 unités/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine. Réchauffez le support à 37 °C avant de l’utiliser.
- Milieux de calcification :
- Milieu de calcification A (NaPhos ; utilisé dans les lignées cellulaires de souris) :
- Compléter 100 à 500 ml de DMEM (volume au besoin) avec 10 % de sérum de veau fœtal, 2 mM de phosphate de sodium, 100 unités/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine. Réchauffez le support à 37 °C avant utilisation.
Ou
- Milieu de calcification B (βGP/Asc/DEX ; utilisé dans les lignées cellulaires de souris ou humaines) :
- Compléter 100 à 500 ml de DMEM (volume au besoin) avec 10 % de sérum de veau fœtal, 10 mM de β-glycérophosphate disodique, 50 μg/ml d’acide L-ascorbique, 10 nM de dexaméthasone, 100 unités/ml de pénicilline et 100 μg/ml de streptomycine. Réchauffez le support à 37 °C avant de l’utiliser.
2. Dissection de la souris
- Euthanasier la souris avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital de 200 mg/kg.
- Posez l’animal en décubitus dorsal sur la planche de dissection et stabilisez-le en collant chaque patte sur la planche. À l’aide d’un microscope de dissection et de petits ciseaux, faites une incision médiane s’étendant du bas-ventre au haut du thorax.
- Pelez la peau avec une pince et retirez le péritoine, révélant les organes abdominaux. Retirez les organes gastro-intestinaux en prenant soin de ne pas transecter l’aorte.
- Faites une incision latérale dans le diaphragme antérieur et continuez l’incision à travers l’abdomen. À l’aide de ciseaux de dissection, libérez la cage thoracique en coupant les côtés des côtes et en retirant les tissus mous adhérents à la partie supérieure du sternum. Retirez la cage thoracique, révélant les poumons.
- Laissez le cœur en place au départ (pour aider à identifier et à disséquer l’aorte proximale) et retirez soigneusement les poumons. Retirez le thymus, la trachée et l’œsophage avec soin, en veillant à ce que l’aorte reste intacte.
- À l’aide d’une pince fine droite et de ciseaux de micro-dissection, retirez les tissus mous entourant l’aorte de la bifurcation iliaque à l’arc aortique, en portant une attention particulière lors de l’élimination de la graisse péri-aortique (Figure 1A). Enlever la graisse et les tissus mous restants entourant les grandes branches de l’arc aortique (c.-à-d. les artères brachiocéphalique, carotide commune et sous-clavière, figure 1B).
note: Il est important d’enlever la graisse de l’aorte car la graisse peut augmenter le signal de fond lors de l’imagerie par fluorescence.
- Retirez le cœur de la cavité thoracique, en le détachant soigneusement de l’aorte proximale, et jetez-le. Transect de l’aorte distale au niveau de la bifurcation iliaque. À l’aide d’une aiguille à insuline, injectez une solution saline normale dans l’aorte à partir de l’arc aortique pour éliminer les cellules sanguines restantes. Détachez l’aorte avec les vaisseaux de l’arc aortique, en l’enlevant complètement du corps.
- Placez l’aorte dans une solution saline normale sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête pour l’imagerie.
3. Isolement des cellules musculaires lisses vasculaires aortiques primaires murines
- Placez les aortes dans le HBSS froid jusqu’à ce que les dissections soient terminées. Coupez soigneusement la graisse périaortique et les tissus mous restants, ne laissant que l’aorte.
- Sous une hotte stérile de culture tissulaire, transférez les aortes dans la solution de digestion aortique dans des boîtes de culture tissulaire de 35 mm x 10 mm. Placer dans un incubateur à 37 °C pendant 30 min avec un léger balancement intermittent. Après la digestion, les aortes présentent un aspect étiré ou effiloché.
- À l’aide du microscope de dissection et d’une pince stérile, retirez la couche adventice externe de l’aorte tout en gardant la couche médiane intacte. Une technique pour enlever l’adventice consiste à décoller la couche externe de l’aorte à une extrémité et à la retirer de la couche médiane sous-jacente comme une chaussette pourrait être retirée et retirée.
- Une fois la couche adventice éliminée, placez l’aorte restante dans une nouvelle boîte de culture tissulaire avec un milieu de culture cellulaire et conservez-la à 37 °C avec 5 % de CO2 pendant 2 à 4 heures.
- Sous une capuche stérile et à l’aide de ciseaux de micro-dissection stériles de 3 mm, coupez l’aorte en anneaux de 1 à 2 mm de large.
- Placez ces anneaux dans une nouvelle boîte de culture tissulaire avec une solution de digestion aortique et incubez à 37 °C avec un léger balancement intermittent pendant 120 min. Pipetez la solution de haut en bas plusieurs fois pendant cette incubation pour remettre les cellules en suspension.
- Ajouter 5 ml de milieu de culture cellulaire chaud à la solution de digestion et transférer dans un tube conique de 15 ml.
- Centrifuger le tube pendant 5 min à 200 x g.
- Aspirez le milieu et remettez les cellules en suspension dans le volume souhaité de milieu de culture cellulaire (par exemple, 5 ml).
- Plaquez la quantité totale de cellules isolées de chaque aorte dans une fiole de culture cellulaire de25 cm et incubez à 37 °C avec 5 % de CO2. Propagez des cellules à l’aide de techniques standard, comme décrit précédemment. Pendant les 7 à 10 premiers jours d’incubation, changez le milieu toutes les 72 à 96 heures. À mesure que les cellules approchent de la confluence, réapprovisionnez les milieux plus fréquemment (toutes les 48 heures).
note: La croissance d’une quantité suffisante de cellules peut prendre plusieurs semaines.
- Une fois confluentes, les cellules de passage avec de la trypsine qui est réchauffée à 37 °C.
- Ajouter 0,5 à 1,0 ml de trypsine dans chaque flacon de culture et incuber pendant 3 à 5 minutes ; tapoter doucement le côté du ballon toutes les 30 à 60 secondes au besoin pour détacher les cellules de la surface.
- Une fois que les cellules se sont détachées du fond de la fiole, ajoutez 10 ml de milieu cellulaire aux cellules dans la trypsine. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min. Aspirez le milieu et la trypsine de la pastille cellulaire. Remettre les cellules en suspension dans la quantité désirée de milieu cellulaire frais (p. ex., 5 à 10 ml) et les transférer dans un nouveau flacon (certaines cellules étant transférées sur une lame de chambre).
- Lors du premier passage de cellules, confirmer la lignée cellulaire du muscle lisse à l’aide de techniques d’immunocytochimie standard, comme décrit précédemment, en utilisant un anticorps dirigé contre l’actine du muscle α-lisse.
4. Induction de la calcification de cellules musculaires lisses en culture
- Cellules sur plaque obtenues à partir de 3.12 dans un format 6 puits.
note: Il est recommandé de commencer avec 1 x 105 cellules/puits dans un volume total de 2,0 ml de milieu cellulaire par puits.
- Permet aux cellules de se développer dans le milieu de calcification A ou B pendant au moins 7 jours dans un format de plaque à 6 puits. Incuber les cellules à 37 °C avec 5 % de CO2.
- Changez de support cellulaire toutes les 48 heures.
5. Évaluation de la calcification des VSMC à l’aide de la méthode de coloration de von Kossa
REMARQUE : La méthode de von Kossa pour mesurer la calcification de la matrice extracellulaire de tissus ou de cellules cultivées est basée sur la substitution d’ions calcium liés au phosphate par des ions argent. En présence de composés légers et organiques, les ions argent sont réduits et visualisés comme de l’argent métallique. Tout argent n’ayant pas réagi est éliminé par un traitement au thiosulfate de sodium. Le protocole de coloration de von Kossa est le suivant :
- Aspirer les milieux des plaques de culture cellulaire.
- Fixez les cellules en les plaçant dans 1 ml de formol à 10 % à température ambiante pendant 20 min.
- Retirez le formol et lavez les cellules fixées avec de l’eau distillée pendant 5 min.
- Incuber les cellules dans 1 ml de solution de nitrate d’argent à 5 % sous une ampoule de 60 à 100 W pendant 1 à 2 heures.
- Aspirez la solution de nitrate d’argent et lavez-la à l’eau distillée pendant 5 min.
- Éliminez l’argent n’ayant pas réagi en plaçant les cellules dans 1 ml d’une solution de thiosulfate de sodium à 5 % (p/v) dans de l’eau distillée pendant 5 min.
- Rincez les cellules à l’eau distillée pendant 5 min. Répétez les lavages 3 fois. La coloration de von Kossa est prête pour l’imagerie avec la microscopie à lumière inversée standard.
- Étape facultative : Contre-colorez avec 1 ml de rouge nucléaire pendant 5 min. Poursuivez avec trois lavages à l’eau distillée (5 min chacun).
