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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Protocole de coloration à l’éosine
- Pour fixer des échantillons de tissus mous, remplissez un tube à centrifuger de 50 mL avec une solution fixatrice contenant 9,5 mL de solution de formaldéhyde (FA) à 4 % (v/v) et 0,5 mL d’acide acétique glacial (AA).
note: Préparez la solution d’AF fraîchement à partir d’une solution d’AF sans acide à 37 % stabilisée avec environ 10 % de méthanol. Diluez davantage la solution de FA avec la solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS). Choisissez DPBS sans calcium ni magnésium. Ne conservez pas la solution diluée d’AF plus d’un mois. Pendant l’acidification, le pH de la solution fixatrice passe de neutre à environ 3,
prudence: Étant donné que l’AF est toxique, corrosif et cancérigène aigu pour les organes, l’utilisation d’une hotte est obligatoire et un équipement de protection individuelle approprié doit être utilisé.
- Ajouter l’échantillon de tissus mous fraîchement prélevé dans un tube à centrifuger de 50 mL et réfrigérer le tube à centrifuger de 50 mL pendant 24 à 72h
note: Le protocole peut être mis en pause ici.
- Laver l’échantillon de tissus mous avec la solution DPBS pendant 1 h.
- Pour colorer l’échantillon de tissus mous fixé (par exemple, un rein de souris entier), placez les tissus mous dans 2 ml de solution de coloration à l’éosine Y et incubez l’échantillon pendant 24 h. Conservez l’échantillon sur une plaque d’agitation horizontale pour un balancement en douceur (environ 60 tr/min) pendant le processus d’incubation.
note: La solution de coloration à l’éosine Y a une concentration de 30 % (p/v) dans l’eau distillée. Choisissez le volume de la solution de coloration de manière à ce que l’échantillon soit complètement recouvert par la solution de coloration et permettez à l’échantillon de se déplacer librement à l’intérieur du récipient d’échantillon. Le temps d’incubation peut différer pour d’autres échantillons et doit être ajusté en conséquence.
- Après la coloration, retirez soigneusement l’échantillon de tissus mous du récipient d’échantillon.
- Enlevez soigneusement l’excès d’agent colorant avec du papier de soie en cellulose.
- Placez l’échantillon de tissus mous dans un récipient d’échantillon conique au-dessus d’une phase vapeur d’éthanol pour le stockage et l’utilisation ultérieure.
note: Le récipient d’échantillon conique doit toujours contenir quelques gouttes d’éthanol à 70 % (v/v) au fond du tube pour garder l’échantillon de tissus mous humide et éviter les artefacts.