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1. Préparation des solutions de coloration
- Filtrez la solution mère d’hématoxyline Harris pour éliminer les solides qui ont précipité.
- Pliez un filtre à café en deux pour que le filtre crée un cône. Ouvrez le panneau latéral de manière à ce que le liquide s’écoule à travers le filtre, ce qui permet d’attraper les débris.
- Placez le filtre à l’intérieur d’un entonnoir et l’entonnoir dans une bouteille en verre. Versez progressivement l’hématoxyline de base à travers le filtre.
prudence: L’hématoxyline est dangereuse en cas de contact avec les yeux, d’ingestion et d’inhalation. Portez toujours une blouse de laboratoire et des gants et manipulez la solution mère dans une cagoule chimique.
- Préparez du HCl à 0,05 % en ajoutant 125 μL de HCl 12 N à 250 mL de ddH2O.
- Préparez un mélange de solution d’éosine Y-phloxine B en combinant 25 ml d’éosine Y à 1 % (aq), 2,5 ml de phloxine B à 1 % (aq), 195 ml d’éthanol à 95 % et 1 ml d’acide acétique glacial dans une bouteille en verre. Bien mélanger en remuant et conserver à RT
prudence: L’éosine Y est dangereuse en cas de contact oculaire, d’ingestion et d’inhalation. Portez toujours une blouse de laboratoire et des gants et manipulez la solution mère dans une cagoule chimique.
- Préparez de l’éthanol à 2 % en ajoutant 2 ml d’alcool éthylique pur à 98 ml d’eau d’œuf.
prudence: L’alcool éthylique est un irritant pour les yeux. Portez toujours un équipement de protection approprié lorsque vous manipulez de l’alcool éthylique. Il est également inflammable et doit être manipulé et stocké en conséquence.
REMARQUE : Préparez de l’éthanol frais à 2 % à chaque fois avant d’effectuer le traitement aigu à l’éthanol.
2. Coloration à l’hématoxyline et à l’éosine des sections de paraffine
- Déparaffinisez les lames en les trempant dans du xylène à 100 % pendant 15 min ; changez-les en 100 % xylène frais pendant 15 minutes supplémentaires.
- Réhydratez les lames en les trempant dans la série suivante d’éthanol gradué jusqu’à ce que le liquide s’écoule proprement des lames. Pour chaque solution, tremper 8 à 10 fois, 2 s par trempage : 100 % d’éthanol, 100 % d’éthanol, 95 % d’éthanol, 95 % d’éthanol, 70 % d’éthanol, 50 % d’éthanol, 30 % d’éthanol et de l’eau déminéralisée
note: Le protocole peut être arrêté ici, et les lames peuvent être laissées à RT dans l’eau pendant plusieurs heures. Si nécessaire, les lames peuvent être stockées à 4 °C dans de l’eau O/N.
- Placez les lames dans de l’hématoxyline Harris filtrée à 100 % pendant 4 min. Transférez-les immédiatement dans le récipient avec de l’eau déminéralisée. Faites couler de l’eau désionisée dans le coin arrière du récipient le plus éloigné des sections. Videz le récipient périodiquement jusqu’à ce que l’eau ne soit plus violette.
note: Ne laissez pas l’eau couler directement sur les toboggans, car les sections pourraient se détacher des toboggans.
- Vérifiez rapidement l’intensité de l’hématoxyline sur un microscope à dissection à l’aide de lampes à col de cygne ; ne laissez pas les lames sécher. Si la tache a atteint l’intensité souhaitée, passez à l’étape suivante. Si la couleur n’est pas assez foncée, placez les lames dans de l’hématoxyline à 100 % pendant 1 min et répétez les lavages à l’eau avant de vérifier à nouveau.
note: L’hématoxyline doit être suffisamment foncée pour que la couleur ne soit pas perdue lors de la coloration à l’éosine. Cependant, si une coloration à l’hématoxyline est observée dans le cytoplasme, les sections sont surcolorées.
- Trempez les lames deux fois dans du HCl à 0,05 % et transférez-les immédiatement dans le récipient avec de l’eau déminéralisée propre. Videz l’eau et remplissez le récipient avec de l’eau deux fois.
- Transférez les lames à 95 % d’éthanol pendant 30 s, puis transférez-les dans un nouveau récipient avec de l’éthanol à 95 % pendant 30 s.
- Placez les lames dans la solution d’éosine Y-Phloxine B pendant 2 min. Transférez les lames dans le récipient précédent d’éthanol à 95 % et vérifiez rapidement l’intensité de la couleur sous le microscope à dissection. Si la coloration est suffisante, passez à l’étape suivante. Si ce n’est pas le cas, revenez à la solution d’éosine pendant 30 s, vérifiez à nouveau et répétez l’opération si nécessaire.
note: Une coloration suffisante à l’éosine est rose vif et contraste nettement avec la coloration à l’hématoxyline. Assurez-vous d’essuyer toute solution au dos des lames lors de la vérification au microscope afin qu’aucune fausse couleur ne soit observée. Parce que l’éosine est composée à 95 % d’éthanol, des périodes prolongées dans de l’éthanol à 95 % tout en vérifiant l’intensité de la couleur peuvent lessiver une partie de la couleur.
- Transférez les lames à 100 % d’isopropanol pendant 15 s. Remplacez-les par de l’isopropanol frais à 100 % et replacez les lames dans l’isopropanol pendant 15 secondes supplémentaires. Répétez ce processus pour un total de 6 lavages d’isopropanol.
prudence: L’isopropanol est un irritant pour les yeux et les voies respiratoires. Assurez-vous toujours de porter un équipement de protection approprié et d’éviter les éclaboussures. Il est également hautement inflammable et doit être stocké et manipulé en conséquence.
note: Pour économiser sur les réactifs, jetez uniquement le premier lavage à l’isopropanol (le plus rose). Conservez les cinq autres solutions de lavage dans des bouteilles numérotées de 1 à 5, pour être réutilisées pour la prochaine coloration. Lorsque vous réutilisez des lavages, commencez par la bouteille numérotée « 1 » et jetez-la après utilisation. Une fois que le lavage « 2 » a été utilisé, versez-le dans la bouteille « 1 », et ainsi de suite. Le lavage final doit toujours être de l’isopropanol frais.
- Placez les lames dans des xylènes à 100 % pendant 3 min. Retirez une lame à la fois et placez une lamelle.
- Ajoutez suffisamment de support de montage pour couvrir les sections et trempez-les dans 100 % de xylène.
note: Cette étape permettra de lisser la surface du support de montage et d’éliminer les bulles.
- Appliquez une lamelle au bas de la diapositive.
note: Le support de montage doit tirer la glissière en position. Si la lamelle n’est pas droite ou complètement en place, tapotez-la doucement pour la mettre en place.
- Épongez tout excès de support de montage sur une serviette en papier jusqu’à ce qu’il n’y ait qu’une fine ligne. Trempez une lingette en tissu dans le xylène et essuyez l’arrière de la lame pour enlever tout milieu qui a coulé. Placez la diapositive à plat sur une surface solide mais mobile, comme un morceau de carton. Couvrez-moi toutes les lames restantes de la même manière. Laisser le xylène s’évaporer dans la hotte pendant 10 min.
note: Tous les matériaux contaminés par du xylène doivent être retirés et jetés dans un récipient scellé dans la hotte pour empêcher les vapeurs de s’échapper.
- Laissez le fluide de montage durcir à RT O/N.
3. Imagerie et stockage des lames colorées
- Coupes d’images sur un microscope inversé composé.
note: Les lames peuvent être conservées à température ambiante indéfiniment.