Coloration au bleu de méthylène pour évaluer la formation de colonies métastatiques in vitro : une procédure de coloration pour évaluer les métastases en quantifiant les cellules cancéreuses récoltées à partir d’un modèle de souris cancéreuse

Résumé

Source : Nagai-Singer, M. A., et al. Utilisation de l’analyse d’images assistée par ordinateur pour améliorer la quantification des métastases pulmonaires dans le modèle de cancer du sein 4T1. J. Vis. Exp. (2020)

Dans cette vidéo, nous décrivons la procédure de coloration au bleu de méthylène pour quantifier la charge métastatique en comptant les colonies colorées obtenues par culture de cellules cancéreuses prélevées sur des organes éloignés d’un modèle murin après injection.

Protocole

Toutes les procédures de modèle animal ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Traitement des tissus

REMARQUE : Toutes les étapes de cette section doivent être effectuées à l’aide d’une technique stérile.

1. Étiquetez 1 tube conique de 15 ml par souris et ajoutez 2,5 ml de mélange de collagénase de type IV et 30 unités d’élastase dans chaque tube. Pour faire un mélange de collagénase de type IV, dissoudre 2 mg de collagénase de type IV par mL 1x HBSS et filtre stérile. Il peut être conservé jusqu’à 12 mois à -20 °C et décongelé si nécessaire.
2. Transférez le poumon de souris récolté dans le deuxième puits 1x HBSS propre pour cet échantillon. Agitez à l’aide d’une pince pour enlever le sang restant. Transférez le poumon propre dans une plaque de culture tissulaire vide de 3,5 cm. Émincez le poumon avec des ciseaux. Rincer la plaque avec 2,5 mL de 1x HBSS, transférer 1x HBSS et les morceaux de poumon dans un tube conique de 15 mL contenant déjà un cocktail collagénase/élastase (5 mL au total).
3. Incuber pendant 75 minutes à 4 °C. Continuez à mélanger les échantillons pendant ce temps, placez donc les tubes sur une bascule ou une roue rotative. Au cours de cette étape d’incubation, étiquetez des tubes à centrifuger de 50 mL et des plaques de culture tissulaire de 10 cm pour chaque souris. Si vous effectuez une dilution, étiquetez suffisamment de plaques de culture tissulaire de 10 cm pour les dilutions.
   note: Étiquetez le couvercle des plaques de culture tissulaire. Si vous étiquetez la plaque elle-même, l’écriture interférera avec l’analyse Fiji-ImageJ.
4. Portez le volume de chaque tube jusqu’à 10 mL au total avec 1x HBSS. Verser le contenu sur une passoire de 70 μm dans un tube conique de 50 mL pour chaque échantillon. À l’aide du piston d’une seringue de 1 ml, broyez doucement l’échantillon à travers la crépine afin de permettre à un plus grand nombre de cellules de filtrer.
5. Centrifuger pendant 5 minutes à 350 x g à température ambiante (RT). Jeter le surnageant et laver la pastille avec 10 mL de 1x HBSS. Répétez cette étape deux fois.
6. Mettre la pastille en suspension dans 10 mL de milieux de culture complets 60 μM 6TG, RPMI ou IMDM. Plaquez les échantillons dans des plaques de culture cellulaire de 10 cm, en utilisant un schéma de dilution si vous le souhaitez. Incuber à 37 °C, 5 % CO₂ pendant 5 jours.
   REMARQUE : Les dilutions 1:2, 1:10 et 1:100 sont des dilutions courantes qui devront être déterminées empiriquement en fonction des paramètres de l’étude.
   ATTENTION : Le 6TG est toxique. Soyez prudent lors de la manipulation et suivez toutes les directives en matière d’environnement, de santé et de sécurité pour l’élimination.

2. Plaques de coloration

1. Verser les milieux de culture des plaques dans le récipient à déchets approprié. Fixez les cellules en ajoutant 5 mL de méthanol non dilué par plaque et incubez pendant 5 minutes à RT, en veillant à faire tourbillonner le méthanol de manière à ce qu’il recouvre toute la plaque.
   prudence: Le méthanol est dangereux s’il est ingéré, inhalé ou sur la peau. Utilisez une hotte pour cette étape.
2. Versez le méthanol des plaques dans le conteneur à déchets approprié. Rincer les plaques avec 5 ml d’eau distillée par assiette et verser l’eau dans le récipient à déchets approprié. Ajouter 5 ml de bleu de méthylène à 0,03 % par assiette et incuber pendant 5 minutes à RT, en veillant à faire tourbillonner la solution de bleu de méthylène de manière à ce qu’elle recouvre toute la plaque.
3. Versez le bleu de méthylène dans le conteneur à déchets approprié. Rincez à nouveau les assiettes avec 5 ml d’eau distillée par assiette. Retournez les assiettes et épongez contre une serviette en papier pour enlever l’excès de liquide. Placez l’assiette sur son couvercle et laissez sécher à l’air libre pendant la nuit à RT.
   note: Les colonies métastatiques seront bleues. Une fois les plaques séchées, elles peuvent être stockées chez RT indéfiniment.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
méthanol	Fisher Scientific	A412SK-4
Bleu de méthylène	Sigma-Aldrich	Référence 03978-250ML
RMPI-1640 Moyen	ATCC	30-2001
Bascule ou roue rotative	quelconque	quelconque
Filtre jetable stérile avec membrane PES	ThermoFisher Scientific	Référence 568-0010
Collagénase de type IV	Sigma-Aldrich	Réf. C5138
Plaques de culture tissulaire de 3,5 cm	Nunclon	153066
Plaques de culture tissulaire de 10 cm	Fisher Scientific	Tél. : 08-772-22
Tube à centrifuger de 15 mL	Fisher Scientific	14-959-70C
1X solution saline équilibrée de Hank (HBSS)	Thermo Scientific	SH3026802
Tube à centrifuger de 50 mL	Fisher Scientific	Référence 14-959-49A
Crépine à cellules de 70 μM	Fisher Scientific	Tél. : 22-363-548
70 % d’éthanol	Sigma Aldrich	E7023	Diluer à 70 % avec de l’eau DI
incubateur			Doit être capable de produire 5 % de CO2 et 37 °C
forceps	Roboz	RS-8100
centrifugeuse	quelconque	quelconque	Doit être capable de 125 x g et 300 x g
eau distillée	quelconque	quelconque
Élastase	MP Biomédical	100617