Coloration périodique à l’acide des cellules : une technique in vitro pour détecter les niveaux de glycogène dans les cellules mononucléées du sang périphérique

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Isolement PBMC du sang total

REMARQUE : Effectuer cette procédure dans une enceinte de biosécurité en utilisant une technique stérile et un équipement stérilisé par le fabricant.

1. Versez avec précaution 10 à 15 ml de sang total des tubes de prélèvement sanguin hépariné (anticoagulant) dans un tube conique stérile de 50 ml. En cas de déversement mineur de sang, essuyez avec du ddH₂O et 70 % d’EtOH à l’aide d’un chiffon de nettoyage.
2. Diluez le sang dans le tube conique à un rapport de 1:1 avec une solution saline tampon phosphate (PBS 1x) pH 7,4. Veillez à ce que le volume total maximal ne dépasse pas 30 ml.
3. Mélangez délicatement à l’aide d’un pistolet pipette sérologique en évitant les bulles.
   note: Ne mélangez PAS en inversant le tube pour éviter l’accumulation de sang dans le capuchon et l’infiltration ultérieure pendant la centrifugation.
4. Ajouter 13 ml de Ficoll-paque (voir tableau des matériaux), dans un nouveau tube conique de 50 ml. Gardez le tube à la verticale dans le panier.
5. À l’aide d’une pipette de transfert, prélevez du sang dilué, touchez la pointe de la pipette de transfert sur la paroi intérieure du tube près du haut. Avec une pression lente et régulière, transférez le sang le long de la paroi intérieure du tube en formant une couche de sang au-dessus de la couche de saccharose. Faites cette étape plusieurs fois jusqu’à ce que tout le sang ait été transféré.
6. Fermez hermétiquement le tube et centrifugez-le à température ambiante pendant 30 min à 700 x g dans un rotor pivotant avec une accélération moyenne réglée sur 5 et une décélération réglée sur ZÉRO.
7. Retirez lentement le tube et, sans déranger les couches, ramenez-le dans l’enceinte de biosécurité.
8. Prélever soigneusement la couche leucocytaire (fine couche blanche trouble), où se trouvent les PBMC, placée entre les couches de PBS/plasma et de ficoll à l’aide d’une pipette de transfert. Évitez de collecter la couche de saccharose et ne dérangez pas la couche de globules rouges.
9. Transférez la couche leucytaire dans un nouveau tube conique stérile de 50 ml. Il peut s’écouler plusieurs fois que l’on répète l’étape 1.8 pour collecter tous les PBMC.
10. Ajoutez du PBS pH 7,4 dans le tube avec le PBMC et remplissez jusqu’au repère de 45 ml. Agitez soigneusement le tube. Ne faites pas de vortex.
11. Lavage 1 : Centrifugeuse pendant 15 min à 480 x g avec accélération et décélération maximales réglées sur 9. Observez la formation d’une pastille de PBMC au fond du tube conique.
12. Jeter le PBS (surnageant) dans un bécher en plastique avec 10 ml d’eau de Javel.
13. Détachez les granules de cellules en les « soutirant » doucement contre une surface ondulée (c’est-à-dire une grille vide). Ne faites pas de vortex.
14. Ajoutez 25 ml de PBS frais pH 7,4 dans le tube. Si plus d’un tube est traité, regroupez les granulés à cette étape.
15. Lavage 2 : Centrifugez le tube pendant 12 min à 480 x g avec l’accélération et la décélération maximales réglées sur 9.
16. Jetez le PBS (surnageant) dans le bécher en plastique avec un peu d’eau de Javel.
17. Frottez doucement contre une surface ondulée (c’est-à-dire un panier vide). Ne faites pas de vortex.
18. Ajoutez 25 ml de PBS frais dans le tube.
    1. Retirez 50 μl des cellules et transférez-les dans un tube de microcentrifugation pour le comptage de la viabilité.
    2. Ajoutez une quantité égale (50 μl) de bleu trypan (une coloration de viabilité) et pipetez de haut en bas pour mélanger doucement.
19. Prélevez 10 μl et transférez-le dans un hémocytomètre pour vérifier la viabilité des cellules par ml. Notez le nombre de cellules/ml.
20. Retirez la quantité souhaitée de cellules et centrifugez le tube pendant 12 minutes à 480 x g avec une accélération et une décélération maximales réglées sur 9.
21. Jetez le PBS (surnageant) dans le bécher avec de l’eau de Javel.
22. Frottez doucement contre une surface ondulée (c’est-à-dire un panier vide). Ajoutez 80 μl de PBS dans le tube.

2. Réalisation de la diapositive PBMC

1. Placez 80 μl des cellules sur une lame de microscope. Étalez la goutte à l’aide d’une autre lame ou placez 2 gouttes de 40 μl chacune aux deux extrémités de la lame.
2. Laissez sécher la lame dans l’enceinte de sécurité biologique. Étiquetez la diapositive avec un crayon sur le côté givré.

3. Fixation des échantillons sur les lames

1. Préparez la solution fixatrice en mélangeant 0,5 ml de formaldéhyde à 37 % et 4,5 ml d’éthanol à 99 %.
2. Une fois les lames séchées, prélevez 2 ml de la solution fixatrice fraîchement préparée et versez-la sur la lame de manière à ce que toute la surface de la lame soit couverte.
3. Laissez la solution sur la lame pendant 1 min. Rincez la lame pendant 1 minute à l’eau du robinet et laissez-la sécher à l’air.

4. Fabrication de la solution de l’amylase pour le contrôle négatif

1. Prenez 0,25 g de poudre d’amylase et dissolvez-la dans 50 ml d’eau distillée. Versez la solution dans un bécher propre de 100 ml.
2. Immergez la lame dans le bécher de manière à ce que la moitié de la lame reçoive le traitement et que l’autre moitié ne soit pas traitée, puis incubez pendant 15 min à température ambiante (Figure 1C).
3. Notez de quel côté de la lame reçoit le traitement à l’amylase. Tracez une ligne au dos de la diapositive indiquant la limite entre le traitement et le contrôle.
4. Lavez les lames avec de la ddH₂O pour éliminer la solution d’amylase et laissez la lame sécher à l’air.

5. Effectuer une coloration et une imagerie périodiques à l’acide de Schiff (PAS)

REMARQUE : Les réactifs PAS sont toxiques par inhalation et sont corrosifs, de sorte que les étapes doivent être effectuées dans une hotte chimique, et les déchets doivent être correctement éliminés conformément aux directives institutionnelles.

1. Placez la lame sur une surface plane et versez 1,50 à 2,00 ml de solution acide périodique sur l’échantillon. Incuber 5 min à température ambiante.
2. Rincez les lames en plusieurs charges d’eau distillée.
3. Versez 1,50 à 2,00 ml de réactif de Schiff sur la lame et incubez-le à température ambiante pendant 15 min.
4. Lavez la lame à l’eau distillée pendant 5 minutes et laissez-la sécher à l’air libre.
5. Appliquez un support de montage de 10 μl sur la glissière et couvrez-le avec deux petites lamelles, ou appliquez 50 μl et utilisez une grande lamelle.
6. Appliquez du vernis à ongles transparent sur les bords de la lamelle, laissez sécher toute la nuit.

6. Obtenir des images avec le microscope optique binoculaire à l’aide de l’objectif 100X

Figure 1 : Méthodologie étape par étape de la coloration PAS sur PBMC.(A) Tout d’abord, l’isolement du PBMC est réalisé par un gradient de ficoll, le panneau de gauche montre la préparation avant la centrifugation, le panneau de droite le montre après la centrifugation où la couche leucalaire contenant le PBMC est observée au centre du tube. (B) Les PBMC isolés sont fixés sur la lame à l’aide d’une solution fixatrice de formol et d’éthanol. La lame est rincée doucement avec de l’eau distillée à partir d’une bouteille de lavage en plastique. (C) La lame est ensuite placée dans un bécher de 100 ml à moitié rempli d’une solution d’amylase, qui dissoudra le glycogène. La lame est rincée doucement. (D) La lame est traitée avec une solution acide périodique, où l’oxydation des saccharides a lieu. Les lames sont rincées doucement ; Cela éliminera l’excès d’acide périodique et arrêtera l’étape d’oxydation. (E) Lorsque le réactif Schiff est ajouté aux lames, il réagit avec les aldéhydes créés pendant l’étape d’oxydation. Ce réactif incolore donnera alors un produit magenta rouge foncé. Les lames sont rincées doucement pour éliminer l’excès de réactif Schiff.