Coloration au violet de crésyle de coupes de tissus : une procédure de coloration pour visualiser le cartilage et les os dans des coupes d’embryons de souris congelés

Résumé

Source : Wu, Meng, et al., Microdissection par capture laser du cartilage embryonnaire et de l’os de souris pour l’analyse de l’expression génique. J. Vis. Exp.(2019)

Cette vidéo décrit la procédure de coloration au violet crésyl pour visualiser les os et le cartilage dans les coupes coronales d’embryons de souris congelés. Cette technique de coloration aide à différencier les os et le cartilage avec des couleurs distinctes des tissus environnants.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation de l’échantillon pour la microdissection par capture laser

1. Préparez des solutions pour les taches et la déshydratation.
   1. Placez 45 ml d’éthanol à 80 % dans chacun des trois tubes à centrifuger de 50 ml sur de la glace. Étiquetez-les comme #1, #2 et #3. Diluer l’éthanol avec de l’eau sans RNase/DNase.
   2. Placez 45 ml d’éthanol à 95 % dans un tube à centrifuger de 50 ml sur de la glace.
   3. Placez 45 ml d’éthanol à 100 % dans un tube à centrifuger de 50 ml sur de la glace.
   4. Placer 45 ml de xylène dans un tube à centrifuger de 50 ml à température ambiante.
      ATTENTION : Le xylène doit être utilisé dans une hotte.
2. Décongelez brièvement une lame à membrane PEN en la plaçant contre une main gantée, puis lavez-la deux fois pendant 30 s chacune dans 45 mL d’éthanol à 80 % (#1 et #2) en l’agitant dans des tubes à centrifuger de 50 mL pour éliminer l’OCT.
   REMARQUE : Il est important d’enlever l’OCT avant la coloration, afin d’éviter que l’OCT desserré pendant la coloration n’obscurcisse les sections. Des pinces peuvent être utilisées pour faciliter l’élimination de l’OCT qui n’est pas lavé par l’agitation.
3. Posez la diapositive sur une feuille de papier d’aluminium. Pipeter 0,8 mL de violet de crésyle à 0,1 % dans de l’éthanol à 50 % sur la lame et colorer pendant 30 s. Lavez la lame dans 45 ml d’éthanol à 80 % (#3) pendant 30 s, puis déshydratez-la par passage pendant 30 s chacune à travers 45 ml d’éthanol à 95 %, d’éthanol à 100 % et de xylène dans des tubes à centrifuger de 50 ml.
4. Placez les glissières sur un essuie-glace délicat pendant 5 minutes pour drainer le xylène et les sections sèches.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tube à centrifuger	ThermoFisher Scientific	339653	Tubes à centrifuger coniques stériles en polypropylène, 50 mL
Acétate de violet de crésyle	Sigma-Aldrich	Réf. C5042
Essuie-glace délicat	ThermoFisher Scientific	Référence 06-666
eau distillée	Invitrogen	Référence 10977-015	Sans DNase/RNase
Éthanol, absolu (200 proof)	ThermoFisher Scientific	Réf. BP2818	Grade de biologie moléculaire
Glissière à membrane PEN en verre	Microsystèmes Leica	11505158
Composé OCT	Sciences de la microscopie électronique	Référence 102094-106
Agent de décontamination de la RNase	Sigma-Aldrich	R2020	Agent de décontamination RNase pour le nettoyage des surfaces
xylène	Sigma-Aldrich	214736