Coloration fluorescente à l’argent : une technique pour visualiser les protéines totales dans les gels de polyacrylamide

1. Préparation du gel

1. Effectuez SDS-PAGE avec des gels de protéines Bis-Tris de 4 % à 12 % (1 mm, 15 puits) à l’aide d’un mini réservoir de gel rempli d’un tampon d’acide 2-(N-morpholino)éthanesulfonique (MES).
2. Diluez les échantillons avec un mélange d’eau distillée, de tampon de dodécylsulfate de lithium (LDS) et d’un agent réducteur d’échantillons.
3. Chargez la première voie avec le double de la quantité de matière (10 μL), suivie de la quantité de matière normale (5 μL) et d’une série de doubles dilutions de la matière par la suite (13 dilutions, de 2x à 8192x).
4. Faites fonctionner le gel à une tension constante de 200 V pendant 30 min.

2. Fixation du gel

1. Après l’électrophorèse, immerger les gels dans une solution de 100 ml d’éthanol à 40 % et d’acide acétique à l’aide d’un agitateur orbital à 50 tr/min à température ambiante 2 fois (pendant 30 minutes chacune), ou toute la nuit à 4 °C.
2. Lavez les gels 3 x 10 min chacun dans de l’eau ultra-pure dans un récipient propre. L’étape de lavage est cruciale. Si l’acide de la solution de fixation n’est pas correctement éliminé lors de l’étape de développement fluorogène, l’excès de TPE-4TA sera activé par l’acide et entraînera une forte fluorescence de fond dans le gel.

3. Préparation de la solution d’AgNO₃ et imprégnation à l’argent du gel

1. Pour obtenir la solution d’AgNO₃ (0,0001 %) pour l’imprégnation, il faut d’abord dissoudre 0,01 g d’AgNO₃ dans 10 mL d’eau ultrapure pour préparer une solution mère d’AgNO₃ à 0,1 %. Ensuite, ajoutez 100 μL de la solution mère d’AgNO₃ à 0,1 % dans 100 mL d’eau ultrapure pour obtenir la solution de travail.
   note: La solution AgNO₃ doit être conservée à l’obscurité avant d’être utilisée.
2. Imprégnez le gel de 100 mL de solution de travail de l’argent pendant 1 h sur un agitateur orbital à 50 tr/min dans un récipient en verre scellé. Il est essentiel d’effectuer l’imprégnation à l’argent sous une hotte, protégée de la lumière par une feuille d’aluminium.
3. Lavez le gel à l’eau ultra-pure (environ 100 ml) dans un récipient propre pendant 2 x 60 s.

4. Développement fluorogène du gel

1. Pour préparer la solution mère de colorant (0,1 mM), ajoutez 3,0 mg du colorant TPE-4TA dans 50 mL d’eau ultrapure. Soniquez la solution pendant quelques minutes et ajoutez un peu de solution de NaOH (par exemple 1 M) pour aider à dissoudre le colorant.
2. Vérifiez la fluorescence de la solution sous une lampe UV de 365 nm pour vous assurer que la molécule de colorant est complètement dissoute. Seules les solutions faibles ou non émissives indiquent une dissolution complète.
   note: Le colorant TPE-4TA a été synthétisé selon le protocole récemment rapporté par Xie et al.La solution TPE-4TA est très stable et peut être conservée dans l’obscurité pendant des mois.
3. Pour préparer 100 mL de la solution de développement fluorogène (10 μM), ajoutez 10 mL de la solution mère de TPE-4TA dans 90 mL d’eau ultrapure. Vérifiez le pH de la solution à l’aide d’un pH-mètre et réglez-le à 7 - 9 à l’aide d’une solution d’hydroxyde de sodium (1 μM).
4. Transférez le gel dans un récipient propre et refermable contenant 100 ml de solution de développement fluorogénique. Assurez-vous que le gel est totalement immergé dans la solution. Fermez le récipient. Couvrez-le de la lumière et secouez-le pendant la nuit sur un agitateur orbital à 50 tr/min à température ambiante. Alternativement, l’étape d’incubation peut également être raccourcie à environ ~2 h en préchauffant la solution de développement AIE à 80 °C pour la coloration, puis en la laissant à température ambiante.

5. Décoloration et imagerie

1. Transférez le gel dans un récipient propre et détachez-le dans 100 mL d’éthanol à 10 % pendant 30 min.
   note: L’eau seule peut être utilisée pour laver le gel. Cependant, il est plus rapide d’utiliser une solution d’éthanol à 10 % pour la décoloration. Cela permettra de réduire le processus de décoloration de plusieurs heures à 30 minutes.
2. Rincez le gel à l’eau ultra-pure pendant 5 min.
3. Imagez le gel sur le canal 365 nm ou 302 nm par une machine de documentation sur gel.