1. Traitement de la famine pour les larves
REMARQUE : Chez les larves du troisième stade, il y a peu ou pas de gouttelettes lipidiques détectables dans les œnocytes dans des conditions d’alimentation normales, mais de nombreuses grosses gouttelettes lipidiques peuvent être induites dans les œnocytes dans des conditions de stress, telles que la famine. Pour vérifier davantage cette méthode, il est nécessaire de prétraiter ces larves afin d’induire la biogenèse des gouttelettes lipidiques dans les œnocytes. Ici, un temps de famine de 12 h, 24 h et 36 h a été choisi comme paradigme. En particulier, une courte période de famine (par exemple, 3 h) est suffisante pour induire des gouttelettes lipidiques détectables dans les œnocytes. La durée de la famine peut varier en fonction des objectifs et des paramètres expérimentaux spécifiques.
- Fabriquer des chambres pour les traitements de famine et de contrôle.
- Pour les chambres de traitement de famine : placez un papier filtre de taille appropriée dans une boîte de Pétri de 6 cm et pipetez 1 mL de PBS sur le papier filtre.
- Pour les chambres de traitement témoins : placer 5 mL de semoule de maïs standard Bloomington dans la boîte de Pétri.
- À l’aide d’une spatule, déterrez doucement la couche supérieure de la nourriture contenant des larves qui s’enfouissent encore dans la nourriture et transférez-la dans une boîte de Pétri remplie de 5 ml de PBS. Mélangez doucement les larves dans du PBS pour éliminer toute contamination alimentaire des larves et le rendre aussi propre que possible.
- À l’aide d’un petit pinceau, on recueille 40 larves du troisième stade de la même taille approximative. Triez-les au hasard dans une chambre de famine ou de contrôle, avec 20 larves chacune.
- Placez les chambres dans l’incubateur à 25 °C avec 60 % d’humidité et laissez développer pour 12 h, 24 h et 36 h de traitement.
REMARQUE : Pour les larves dans la chambre de famine, ajouter 1 mL de PBS toutes les 12 h pour éviter la déshydratation des larves.
2. Dissection des oenocytes
- À l’aide d’un petit pinceau, prélevez les larves de l’âge approprié (12 h, 24 h ou 36 h après le traitement), puis transférez-les dans une nouvelle boîte de Pétri remplie de 5 mL de PBS glacé à laver><.
REMARQUE : Répétez l’étape 2.2 lorsque vous traitez des larves dans une chambre de contrôle pour éliminer toute contamination alimentaire.
- Remplissez une plaque de dissection avec du PBS glacé et utilisez une pince pour transférer doucement les larves dans la plaque de dissection. Placez la plaque de dissection sous un stéréomicroscope pour l’étape de dissection suivante.
REMARQUE : La température glaciale aidera à ralentir les mouvements des larves et facilitera la dissection.
- Retournez les larves, côté ventral vers le haut et côté dorsal vers le bas, et maintenez-les doucement en place à l’aide d’une pince. Fixez les larves à la plaque de dissection en plaçant une goupille de dissection à travers le pharynx à l’extrémité antérieure et une autre goupille à travers le spiracle à l’extrémité postérieure.
REMARQUE : La face dorsale est plus facilement identifiable par la présence des troncs dorsaux de la trachée.
- Utilisez les ciseaux à ressort Vannas pour inciser (longitudinalement) à travers l’épiderme de l’extrémité antérieure à l’extrémité postérieure.
- Retirez le tissu interne de l’épiderme à l’aide d’une pince
REMARQUE : Des précautions doivent être prises lors de l’ablation des branches trachéales pour éviter d’endommager les œnocytes, qui sont localisés dans la surface interne de l’épiderme.
- À l’aide d’une pince, récupérez les broches de dissection et transférez l’épiderme dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL rempli de PBS sur de la glace.
- Continuez à disséquer d’autres larves en suivant la procédure décrite ci-dessus.
3. Coloration des gouttelettes lipidiques
- Incuber l’épiderme disséqué dans le tampon de fixation pendant 30 min à température ambiante (RT) sur un rotateur.
note: Le tampon de fixation contient 4 % de paraformaldéhyde (PFA) dans le PBS.
- Retirez le tampon de fixation, puis effectuez un lavage rapide. Pour effectuer un lavage rapide, ajoutez 1 mL de PBS à RT dans le tube après avoir retiré le PFA, remettez doucement les tissus en suspension et jetez le PBS.
prudence: Le tampon de fixation contient du PFA, qui est nocif pour la santé humaine. Il est important d’éliminer correctement le tampon de fixation en tant que déchet dangereux.
- Lavez les échantillons 3 fois pendant 5 minutes chacun avec du PBS pour éliminer tous les résidus possibles de PFA.
- Incuber l’épiderme avec BODIPY 493/503 (1 μg/mL ; voir tableau des matériaux) pendant 30 min à RT sur rotateur.
note: À partir de cette étape, enveloppez le tube de microcentrifugation avec un morceau de papier d’aluminium pour protéger les échantillons de la lumière et minimiser le photo-blanchiment possible.
- Retirez la solution de coloration BODIPY 493/503 et lavez les échantillons 3 fois pendant 10 minutes chacun avec du PBS pour éliminer complètement les colorants résiduels.
4. Montage et imagerie
- Placez 6 μL de support de montage sur une lame de microscope propre.
note: Le support de montage est utilisé pour un temps de détection plus long en raison de ses propriétés anti-décoloration.
- À l’aide d’une pince, prélevez un épiderme et retirez délicatement le PBS résiduel avec une lingette.
- Placez l’épiderme dans le support de montage et ajustez son orientation de manière à ce que sa surface interne contenant les œnocytes soit en bas et sa surface externe en haut.
- Placez délicatement une lamelle sur l’épiderme.
note: Retirez tout support de montage supplémentaire qui fuit sous la lamelle avec une lingette, si nécessaire. Pour faciliter l’imagerie, appuyez doucement sur la lamelle à l’aide d’une pince afin que lors de l’observation de la lame au microscope, l’amas d’ovocytes puisse être facilement imagé dans un seul plan. Alternativement, il est possible de couper l’épiderme en deux demi-épidermes par la ligne médiane pour éviter l’enroulement de l’épiderme entier lors du montage des tissus.
- Appliquez du vernis à ongles transparent sur les bords de la lamelle pour sceller.
- Mettez les lames dans une boîte d’échantillons étanche à la lumière et laissez le vernis à ongles sécher à RT, ce qui peut prendre 5 à 10 minutes.
- Procéder à l’analyse microscopique. Prenez des images à l’aide d’un microscope confocal (grossissement de 63x avec les paramètres de filtre GFP ou FITC optimisés, excitation = 488 nm, émission = 503 nm) pour acquérir des signaux propres et sensibles avec un bruit de fond minimisé.
