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1. Solution de coloration LCO
REMARQUE : Si la ZLEA est achetée auprès d'un vendeur commercial, veuillez suivre les instructions du fournisseur plutôt que la section 1.
- Remettre en suspension la ZLEh lyophilisée dans 2 mM de NaOH pour préparer une solution mère de 1 mg/mL. Conservez le bouillon dans un flacon en verre à 4 °C. Le stock peut être stocké pendant un an.
- Le jour de la coloration, préparez une solution de travail en diluant le stock à l’ordre de 1:10 000 dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
2. Préparation des échantillons de tissus
REMARQUE : De nombreux types de tissus peuvent être imagés à l’aide de la ZLEhE comme marqueur amyloïde. Voir la figure 1 pour des exemples. La ZLEA est sensible à la conformation des agrégats. La coloration doit donc être effectuée de préférence sur des agrégats non perturbés sans exposition aux épitopes. Une qualité spectrale optimale est obtenue si la fixation des tissus est réduite au minimum. Par conséquent, il est préférable d’utiliser des matériaux frais congelés, fixés doucement dans de l’éthanol au moment de la coloration. Cependant, il est également possible de détecter des dépôts amyloïdes dans les tissus qui ont été fixés avec, par exemple, du formol. La ZLEhF pénètre généralement bien dans les tissus. Sélectionnez une épaisseur d’échantillon compatible avec la technique d’imagerie prévue.
- Si des sections fixées au formol et incluses dans de la paraffine sont utilisées, le xylène est déparaffiné pendant la nuit. Trempez les sections dans des bains consécutifs de 99 % d’éthanol, 70 % d’éthanol, dH2O et PBS, 10 min dans chacun. Laissez les sections de tissu sécher dans des conditions ambiantes. Attention : Le xylène est toujours manipulé dans une hotte chimique. Le xylène et d’autres solvants organiques sont nocifs.
- Décongeler les cryosections à température ambiante. Fixez les sections de tissu dans du formol à 10 % pendant la nuit et réhydratez-les en les trempant dans des bains consécutifs d’éthanol à 99 %, d’éthanol à 70 %, de dH2O et de PBS, 10 min dans chacun. Laissez les sections de tissu sécher dans des conditions ambiantes.
- Ajoutez des gouttelettes de la solution de travail hFTAA (environ 200 μL) aux coupes de tissu pour la couvrir. La gouttelette doit rester en place par tension superficielle. Incuber pendant 30 min à température ambiante pour la coloration.
- Rincez la solution de coloration avec 500 μL de PBS à l’aide d’une pipette, puis plongez la lame dans le bain PBS pendant 10 min. Laissez la section sécher dans des conditions ambiantes.
- Montage à l’aide du support de montage à fluorescence. Laisser le support de montage se déposer pendant la nuit.
REMARQUE : La coloration hFTAA peut être réalisée en combinaison avec d’autres méthodes de coloration telles que l’immunofluorescence, des marqueurs spécifiques aux cellules ou aux organites, etc. Pour effectuer la co-coloration, exécutez le protocole de coloration complet de votre choix et ajoutez la coloration hFTAA à la fin, en commençant par l’étape 2.2. Voir la figure 2 pour des exemples. Pour l’immunofluorescence, choisissez de préférence un anticorps secondaire qui est excité à 640 nm ou plus. Dans cette gamme de longueurs d’onde, la ZLEhE n’absorbe pas et ne peut donc pas être excité et ne sera pas fluorescente. Cela permet de s’assurer qu’il n’y a pas de fuite entre la ZLEh et l’anticorps.
