Coloration à la phosphatase acide résistante au tartrate : une technique in vitro pour détecter les ostéoclastes cultivés contenant l’enzyme TRAP

Résumé

Source : Dai, Q., et al. Un essai de culture d’ostéoclaste basé sur RANKL pour étudier le rôle de mTORC1 dans la formation des ostéoclastes. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo démontre la technique de coloration à la phosphatase acide résistante au tartrate pour détecter la présence de granules contenant TRAP à l’intérieur des ostéoclastes. La technique forme des dépôts de granules de colorant de couleur magenta dans le cytoplasme des ostéoclastes, les rendant visibles au microscope inversé.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.

1. Préparation

1. Générer des souris de délétion Raptor spécifiques aux ostéoclastes (Raptor^fl/fl ; Ctsk-cre, ci-après Rap^Ctsk) en accouplant des souris Raptor^fl/fl avec des souris Ctsk-cre. Utilisez les souris Raptor^fl/fl comme contrôle WT dans cette étude.
2. Ayez un récipient avec de la glace pour garder l’os isolé.
3. Préparez le milieu de culture.
   1. Préparez le milieu de culture α-MEM en complétant le milieu essentiel minimum alpha (α-MEM) avec 1 x glutamine, de la pénicilline-streptomycine et 10 % de sérum de veau fœtal.
   2. Préparez un milieu d’induction de macrophages de moelle osseuse composé de 50 mL de milieu α-MEM et de M-CSF à 20 ng/mL.
   3. Préparez un milieu d’induction ostéoclaste composé de M-CSF et de RANKL à raison de 20 ng/mL, respectivement, dans 50 mL de milieu α-MEM.
4. Préparez les tampons suivants avant la coloration TRAP.
   1. Préparez une solution fixe composée de 6,5 mL d’acétone, de 2,5 mL de solution de citrate et de 0,8 mL de solution de formaldéhyde à 37 % (vol/vol).
   2. Préparez la solution de coloration TRAP.
      1. Préchauffer l’eau déminéralisée à 37 °C.
      2. Ajouter 100 μL de solution de base de grenat rapide GBC et 100 μL de solution de nitrite de sodium dans un microtube de 1,5 mL et mélanger par inversion douce pendant 30 s. Laisser reposer le mélange pendant 2 min.
      3. Préchauffer 9 mL d’eau désionisée à 37 °C. Ajouter 200 μL de solution de base GBC de grenat rapide diazotisé à partir de l’étape 1.4.2.2, 100 μL de solution de phosphate de naphtol AS-BI, 400 μL de solution d’acétate et 200 μL de solution de tartrate.
      4. Conservez la solution de mélange colorant TRAP dans un bain-marie à 37 °C.

2. Dissection (Jour-1)

1. Euthanasier séparément 3 souris femelles WT et Rap^Ctsk âgées d’un mois par du CO₂. Effectuer l’inhalation de CO₂ avec un équipement approprié par du personnel formé.
2. Immergez 6 souris dans un bécher avec 100 ml d’éthanol à 75 % (vol/vol) pendant 5 min pour éviter la contamination bactérienne, puis placez-les sur une planche de dissection en position couchée. Faites une incision verticalement au niveau distal du tibia et disséquez la peau le long du membre postérieur avec des ciseaux ophtalmiques.
3. Coupez le ligament articulaire de l’articulation de la hanche avec des ciseaux et disloquez les membres postérieurs du tronc.
4. Coupez le ligament articulaire de l’articulation du genou et dissociez soigneusement le tibia et le fémur de l’articulation du genou. Retirez délicatement les tissus mous à l’aide de ciseaux.
5. Placez tous les os d’un génotype dans chaque puits d’une plaque à six puits avec 2 ml de α-MEM sur de la glace.
   note: Pour préserver la viabilité cellulaire, l’os doit être conservé dans ces conditions pendant moins de 1 h.

3. Isolement (Jour-1)

1. Remplissez un puits d’une plaque à six puits avec de l’éthanol à 75 % (3 ml) et les 5 autres puits avec un milieu α-MEM (3 ml).
2. Mettez tous les os d’un génotype dans le lavage à l’éthanol pendant 15 secondes et lavez les os 5 fois avec un milieu α-MEM pendant 10 s à chaque fois.
3. Coupez les épiphyses avec les ciseaux et insérez une aiguille de seringue de 0,45 mm dans la cavité osseuse et rincez la moelle avec un milieu α-MEM dans un tube à centrifuger de 50 ml.
4. Rincer la cavité osseuse en utilisant la même méthode à partir de l’autre extrémité de l’os. Répétez au moins deux fois pour bien laver la cavité osseuse jusqu’à ce que l’os soit pâle.
5. Centrifuger la moelle osseuse pour obtenir une pastille cellulaire à 800 x g et 4 °C pendant 5 min. Aspirer le surnageant.
6. Ajoutez 3 ml de tampon de lyse des globules rouges dans le tube de centrifugation et pipetez doucement pour remettre la moelle osseuse en suspension. Gardez le tube à centrifuger sur de la glace pendant 8 minutes pour lyser les globules rouges.
7. Ajouter 6 ml de milieu α-MEM dans le tube de centrifugation pour arrêter la lyse cellulaire. Centrifuger à 500 x g et 4 °C pendant 10 min et aspirer le surnageant.
8. Remettre en suspension dans 3 mL de milieu de culture α-MEM et placer les cellules dans une plaque à six puits (généralement une souris par puits).
9. Incuber à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant la nuit.

4. Dressage (Jour 0)

1. Transférez le surnageant dans un tube à centrifuger de 15 mL pour recueillir les cellules non attachées le lendemain matin.
2. Centrifuger à 800 x g et 4 °C pendant 5 min et aspirer le surnageant.
3. Remettre en suspension dans 4 mL de milieu de culture α-MEM.
4. Prélever 20 μL de la solution cellulaire et mélanger avec 20 μL de Trypan Blue. Ajouter 10 μL du mélange dans la chambre de comptage et obtenir le nombre de cellules par mL de solution.
5. Ajouter un volume approprié de milieu de culture α-MEM pour obtenir une solution cellulaire de 500 000 cellules/mL.
6. Ajouter 500 μL et 50 μL de milieu d’induction des macrophages de moelle osseuse dans chaque puits d’une plaque à 24 puits et d’une plaque à 96 puits, respectivement.
7. Ajouter 500 μL et 50 μL de solution cellulaire dans chaque puits d’une plaque à 24 puits et d’une plaque à 96 puits, respectivement.
8. Incuber à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO₂ pendant 3 jours.

5. Différenciation (jours 3-7)

1. Trois jours après le placage, prélever 50 μL de fluide dans chaque puits de la plaque à 96 puits et congeler à -20 °C, puis aspirer le milieu résiduel.
2. Ajouter 1 mL et 100 μL de milieu d’induction ostéoclastique dans chaque puits d’une plaque de 24 puits et d’une plaque de 96 puits, respectivement.
3. Incuber à 37 °C pendant 2 jours.
4. Prélever 50 μL de milieu dans chaque puits et aspirer le milieu résiduel.
5. Ajouter du milieu d’induction ostéoclaste dans chaque puits.
6. Incuber à 37 °C pendant 1 jour.
   note: À ce stade, les ostéoclastes multinucléés de grande taille doivent être observés au microscope inversé (figure 1A).
7. Si les ostéoclastes ne sont pas visibles, changez le milieu d’induction des ostéoclastes et observez quotidiennement jusqu’à ce que les ostéoclastes soient visibles.
8. Prélever 50 μL de milieu dans chaque puits de la plaque de 96 puits après la formation des ostéoclastes.

6. Coloration à la phosphatase acide résistante au tartrate (TRAP)

REMARQUE : Des ostéoclastes matures peuvent être présents après 6-7 jours de culture in vitro (étape 4).

1. Aspirez le milieu et lavez doucement 3 fois avec 1x PBS.
2. Fixer les cellules dans chaque puits de la plaque à 96 puits avec 100 μL de solution fixe pendant 30 s à température ambiante.
3. Après fixation, aspirez la solution fixe et lavez-la doucement 3 fois avec de l’eau déminéralisée préchauffée à 37 °C. Aspirez de l’eau déminéralisée.
4. Ajoutez 100 μL de colorant TRAP dans chaque puits de la plaque à 96 puits et placez la plaque dans un incubateur à 37 °C pendant 30 minutes et protégez-la de la lumière.
5. Après la coloration, aspirez la tache TRAP et lavez-la doucement 3 fois à l’eau déminéralisée.
6. Imagez les ostéoclastes à l’aide d’un microscope inversé à un grossissement de 40X.

Résultats

Figure 1 : Vue représentative des ostéoclastes.(A) Ostéoclastes géants observés en fond clair le jour 6. La ligne rouge délimitait la bordure des ostéoclastes. (B) Un ostéoclaste typiquement géant, multinucléé, positif à TRAP (rouge vin). La flèche noire indiquait deux noyaux de l’ostéoclaste multinucléé.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Souris Raptorfl/fl	Le Laboratoire Jackson	Référence 13188
Souris Ctsk-cre			un don de S. Kato, Université de Tokyo, Tokyo, Japon
α-MEM	Corning	10-022-CVR
glutamine	Gibico	25030081
Pénicilline streptomycine	Gibico	15140122
Sérum de veau fœtal	BioInd	Référence 04-001-1A
Protéine M-CSF de souris recombinante	R&D	Q3U4F9
Protéine RANKL de souris recombinante	R&D	Q3TWY5
Coussin de lyse des globules rouges	Beyotime	Réf. C3702
Trypan bleu	Sigma-Aldrich	302643
acétone	Shanghai Chemical Co. Ltd.
Solution de citrate	Sigma-Aldrich	915
Solution de formaldéhyde	Shanghai Chemical Co. Ltd.
Kit de phosphatase acide leucocytaire (TRAP)	Sigma-Aldrich	387A-1KT
Solution de base GBC Fast Garnet	Sigma-Aldrich	Référence 3872
Solution de nitrite de sodium	Sigma-Aldrich	914
Solution de phosphate de naphtol AS-BI	Sigma-Aldrich	Référence 3871
Solution d’acétate	Sigma-Aldrich	Référence 3863
Solution de tartrate	Sigma-Aldrich	Référence 3873
Solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco	Corning	21-031-CVR
37 % formaldéhyde	Xilong scientifique
IX71	Olympe
Seringue de 0,45 mm
Ciseaux
Pince à moustiques