Coloration au rouge d’alizarine : une technique pour visualiser la minéralisation par des ostéoblastes cultivés

Résumé

Source : Kampleitner, C., et al. Profil de compatibilité biologique sur les biomatériaux pour la régénération osseuse. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo présente une technique de coloration permettant de détecter l’étendue de la minéralisation ou du dépôt de calcium dans des ostéoblastes primaires cultivés à l’aide d’un colorant rouge d’alizarine.

Protocole

1. Minéralisation de l’ostéoblaste (OB) évaluée par coloration au rouge d’alizarine S (ARS)

1. Ajoutez des ostéoblastes primaires (OB) aux disques de phosphate β-tricalcique (β-TCP) utilisés comme échafaudage biocompatible dans une plaque de culture.
2. Aspirer le milieu de culture des puits contenant les OB primaires 14 jours après l’ajout du milieu de minéralisation et rincer deux fois avec 0,5 mL de 1x PBS à RT. Aspirer le PBS et fixer les cellules en ajoutant 0,5 mL de la solution de formol tamponnée à 10 % à RT pendant 10 min.
3. Aspirez le formol tamponné à 10 % à l’aide d’une pipette à usage unique et lavez-le deux fois avec 0,5 ml d’eau ultrapure.
4. Aux OB fixes, ajouter 0,25 mL de solution de coloration ARS 40 mM (pH 4,2) dissoute dans de l’eau ultrapure et incuber la plaque à RT pendant 10 min sur un agitateur à 100 shakes/min.
5. Aspirez la solution de coloration à l’aide d’une pipette à usage unique et rincez avec 1 mL d’eau ultrapure. Répétez cette étape 5 à 10 fois pour éliminer les taches non spécifiques.
   note: La solution de rinçage doit être sans couleur.
6. Aspirez l’eau ultrapure et ajoutez 1 mL de PBS froid. Incuber la plaque à RT pendant 10 min sur un shaker à 100 shakes/min.
7. Aspirez le PBS, transférez les disques β-TCP colorés dans un nouveau puits et scannez les plaques avec un scanner à plat pour enregistrer la minéralisation.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Disques de phosphate β-tricalcique (β-TCP, 14 mm)			Les disques ont été frittés dans un four à moufle à une température de 1150 °C. Une description détaillée de la production se trouve dans Zimmer et al (doi : 10.1002/jbm.a.34639). Les échantillons ont été irradiés aux UV (15 min pour chaque côté) avant d’être utilisés dans des cultures cellulaires.
Mousse Orthovita Vitoss (mousse β-TCP/C)	Orthovita	Référence 2102-1405
Rouge Alizarine S	Sigma-Aldrich	A5533
Solution de formol neutre tamponnée 10 %	Sigma-Aldrich	HT501128
Milieu de minéralisation ostéogénique (MM)			α-MEM + 10 % de FBS inactivé thermiquement + 1 % de pénicilline-streptomycine + 50 μg/mL d’acide ascorbique + 5 mM de β-glycérophosphate
Solution saline tamponnée au phosphate 1x (PBS) pH 7,4	Gibco, Thermo Fisher Scientific	10010023
Eau ultrapure : Eau de culture cellulaire sans pyrogène	VWR	L0970-500
Tampon de lavage			Ajouter 0,05 % de Tween20 à 1x PBS.
Plaque de culture en suspension à 24 puits	Greiner bio-one	662102
Scanner à plat : Epson Perfection 1200 Photo	Epson
Pipette à usage unique : pipette à sérum	Greiner bio-one	612301
eau distillée	Carl Roth	Référence 3478,4
Pipette à usage unique : pipette à sérum	Greiner bio-one	612301