Coloration à l’argent des glycosaminoglycanes sulfatés : une méthode de coloration pour la visualisation des glycosaminoglycanes sulfatés dans des gels de polyacrylamide

Résumé

Source : LaRiviere, W. B., et al. Détection des glycosaminoglycanes par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et coloration à l’argent. J. Vis. Exp. (2021)

Dans cette vidéo, nous montrons une procédure de coloration combinée au bleu d’Alcian et à l’argent de fragments d’oligosaccharides de glycosaminoglycane sulfatés. Cette technique de coloration combinée amplifie considérablement les bandes de polymères de glycosaminoglycanes de différentes longueurs dans les gels de polyacrylamide.

Protocole

1. Protocole de coloration à l’argent

1. Préparez à l’avance toutes les solutions nécessaires à la coloration à l’argent (Tableau 1).
   note: Ne touchez pas directement le gel PAGE tant qu’il n’a pas été coloré, développé et placé dans une solution d’arrêt. Au lieu de cela, manipulez le gel à l’aide d’outils en plastique ou en verre propres. La manipulation directe du gel entraînera des distorsions de l’empreinte digitale et d’autres artefacts visibles sur le gel après la coloration.
2. Une fois le cycle terminé, démontez la cassette et extrayez le gel dans un récipient propre, de taille moyenne à grande, rempli d’eau déminéralisée et filtrée.
   note: Pour éviter de manipuler directement le gel, utilisez la pointe de la pipette ou un autre objet en plastique pour retirer délicatement le gel de la cassette lorsqu’il est immergé dans l’eau. Le gel peut être fragile - manipulez-le avec précaution.
   1. Jetez l’eau. Teindre le gel dans une solution de coloration au bleu d’Alcian pendant 5 min.
   2. Jeter la teinture bleu Alcian. Rincez/lavez rapidement 2 à 3 fois avec de l’eau déminéralisée et filtrée jusqu’à ce que la majeure partie de la solution de coloration au bleu d’Alcian ait été éliminée.
   3. Laisser déteindre dans de l’eau déminéralisée et filtrée pendant la nuit sur une bascule. Assurez-vous qu’il y a un volume suffisant d’eau déminéralisée et filtrée pour vous assurer que toute tache résiduelle est complètement éliminée du gel pendant la nuit.
   4. Laver le gel dans du méthanol à 50 % (40 min au total, changer la solution 2-3x).
   5. Lavez le gel à l’eau déminéralisée et filtrée pendant 30 min. Jetez l’eau et répétez l’opération 3 fois de plus pour un total de 2 h, en remplaçant l’eau à chaque fois.
   6. Dans un récipient frais et propre, colorez le gel pendant 30 minutes dans une solution de coloration au nitrate d’argent.
   7. Rincez/lavez rapidement 2 à 3 fois à l’eau déminéralisée et filtrée pour éliminer complètement la solution de coloration argentée.
   8. Laver pendant 30 min dans de l’eau déminéralisée et filtrée. Jetez l’eau et répétez l’opération 2 fois pour un total de 90 minutes, en replaçant le bain-marie à chaque fois.
   9. Jetez l’eau et ajoutez la solution de développement.
   10. Une fois la solution de développement ajoutée, observez attentivement le gel et surveillez l’apparition de bandes. En fonction de la qualité de la coloration et de la masse de l’échantillon chargé, le développement peut prendre de quelques secondes à plusieurs minutes.
   11. Dès que les bandes souhaitées sont visibles, jetez immédiatement la solution de développement et lavez brièvement avec une solution d’arrêt.
   12. Jetez la solution d’arrêt, lavez-la et remplacez-la par une solution d’arrêt fraîche. Laisser tremper 1 h sur une bascule ou un shaker.
   13. Laver à l’eau déminéralisée et filtrée pendant la nuit (cependant, le gel peut être imagé immédiatement après l’arrêt du lavage de la solution).

Tableau 1 : Solutions requises pour la coloration à l’argent des glycosaminoglycanes séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. Toutes les solutions doivent être filtrées (0,22 μm) avant utilisation.

REMARQUE : Toutes les solutions doivent être filtrées (0,22μm) avant utilisation.
solution	recette	composition	Commentaires
Solution de coloration au bleu d’Alcian (500mL)	Bleu Alcian 8GX en poudre	2,5 g	Concentration souhaitée : 0,5 % p/v
	2 % v/v d’acide acétique glacial	500 ml
Teinture argentée (200 mL)	Désionisée	192,7 ml	Préparez la solution de teinture fraîche ; utilisez-la dans la semaine.
	7,6 M d’hydroxyde de sodium	2 mL	Pour préparer, ajoutez 3,04 g de granules d’hydroxyde de sodium à 10 ml d’eau
	Hydroxyde d’ammonium	3,3 ml
	Solution de nitrate d’argent 4M	2 mL	Pour la fabrication, ajoutez 3,397 g de nitrate d’argent à 5 ml d’eau. Ajouter goutte à goutte tout en remuant pour éviter les précipitations.
Développement d’une solution (501 mL)	Désionisée	500 ml	La solution en développement doit être rafraîchie et utilisée dans les 24 heures.
	2,5 % p/v d’acide citrique	1 mL	Pour préparer, ajoutez 100 mg à 4 ml d’eau déminéralisée. L’acide citrique doit être frais.
	Formaldéhyde	250μL
Solution d’arrêt (500 mL)	Désionisée	300 ml
	Acide acétique glacial	20 mL
	méthanol	90 ml

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bleu Alcian 8GX (solide)	ThermoFisher Scientific	AC400460100
Hydroxyde d’ammonium (liquide)	ThermoFisher Scientific	A669S-500	Certifié ACS
Système de purification d’eau Barnstead GenPure Pro	ThermoFisher Scientific	10-451-217PAQUET	Tout système de déionisation / purification de l’eau est un substitut acceptable
Acide acétique glacial (liquide)	ThermoFisher Scientific	A35-500	Certifié ACS
Méthanol (liquide)	ThermoFisher Scientific	A412-500	Certifié ACS
Nitrate d’argent (solide)	ThermoFisher Scientific	S181-25	Certifié ACS
Hydroxyde de sodium (solide)	ThermoFisher Scientific	S392-212
Unité de filtration sous vide, à usage unique, 0,22 uM pore PES, volume de 500 ml	ThermoFisher Scientific	Référence 569-0020	D’autres volumes et matériaux filtrants sont acceptables
Imageur moléculaire Gel Doc XR System	Bio-Rad	Référence 170-8170	Tout système d’imagerie sur gel comparable est un substitut acceptable