1. Ensemencement pour la culture cellulaire d’expansion et les plaques UFC
- Remettre en suspension les cellules (constituées d’érythrocytes et de cellules mononucléaires) dans 50 ml de milieu basal : Alpha-MEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 100 U/ml de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine et 2,5 mg/ml d’amphotéricine B. Compter les cellules diluées 1:10 dans une solution de Trypan Blue à l’aide d’une chambre de Neubauer.
- Plaquez les cellules dans des flacons de culture cellulaire à la densité de 5 x 10⁷ cellules/cm² et incubez dans un incubateur humidifié à 37 °C. Si possible, utilisez des conditions hypoxiques (5 % d’oxygène). Pour le contrôle du test UFC, plaquez 10⁹ cellules dans une boîte de culture cellulaire de 10 cm de diamètre.
- Après 3 jours de culture, les cellules souches mésenchymateuses sont attachées à la boîte de culture cellulaire tandis que les autres cellules restent en suspension. Changez le milieu avec un milieu basal complété par 5 ng/ml de facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF). Pour le contrôle du test CFU, traitez également la boîte de culture cellulaire.
- Poursuivre la culture cellulaire pendant 2 semaines au total, en échangeant les milieux trois fois par semaine. Si les cellules dépassent 80 % de confluence, divisées par trypsinisation. Pour le contrôle du test CFU, remplacez également les milieux, mais ne divisez pas les cellules pendant les deux semaines.
2. Coloration de Giemsa pour le dosage CFU
- Préparez 10 ml de solution de Giemsa par plat : diluez la solution mère (7,6 g/l de Giemsa dans du glycérol : méthanol) 1:10 dans de l’eau stérile (préparez toujours une dilution de travail fraîche).
- Retirez le milieu de la boîte de culture cellulaire et lavez les cellules avec du PBS. Soyez très prudent lorsque vous appliquez du liquide sur la boîte de Pétri et évitez de laver les cellules.
- Fixez les cellules dans du méthanol pur pendant 5 min à RT. Jetez le méthanol. Ajouter la solution Giemsa et laisser incuber pendant 60 min dans un incubateur humidifié à 37 °C.
- Lavez deux fois avec du PBS. Faites sécher l’assiette à l’air libre sur une serviette en papier. Comptez les colonies manuellement. Le meilleur moyen d’y parvenir est d’utiliser un marqueur à l’arrière de la plaque.