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REMARQUE : Des ponctions de moelle osseuse canine de la crête iliaque ont été prélevées avec le consentement du propriétaire du chien. Les ponctions de moelle osseuse canine (environ 10 ml) ont été anticoagulées par l’ajout de 15 ml de citrate de sodium à 3,8 % immédiatement après le retrait dans la salle d’opération. Les échantillons ont été transférés dans l’environnement du laboratoire pour être traités le jour même du retrait.
1. Préparation de l’urokinase (avant la 1ère utilisation)
- Reconstituer l'urokinase à l'aide d'une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) stérile selon les instructions du fabricant : Ajouter 10 ml de PBS dans le ballon d'entrée de septum à l'aide d'une seringue de 10 ml. Dissoudre la substance sèche en remuant pour obtenir 50 000 unités d’injection (U) par ml.
- Préparez des aliquotes de 500 μl (25 000 U chacune) dans des tubes stériles. Stockez les aliquotes à -20 °C et utilisez-les au besoin pendant au moins 6 mois.
2. Étapes préparatoires (avant chaque traitement de la moelle osseuse)
- Décongeler une aliquote d’urokinase (25 000 U) par aspiration de moelle osseuse coagulée (des volumes d’aspiration allant jusqu’à 25 ml ont été traités avec succès à l’aide d’une seule aliquote de 25 000 U).
- Préchauffez un bain-marie ou un incubateur à 37 °C.
3. Digestion enzymatique du caillot
- Effectuer tous les travaux dans une enceinte de biosécurité à flux laminaire pour éviter la contamination microbienne des échantillons de moelle osseuse pendant le traitement. Lorsque vous travaillez avec du matériel humain potentiellement infectieux, l’utilisation de gants de protection, ainsi qu’une manipulation soigneuse, sont conseillées.
- Placez une passoire à cellules de 100 μm sur un tube stérile de 50 ml. Versez délicatement l’aspiration de moelle osseuse à travers la crépine cellulaire, en inclinant la passoire ou en se déplaçant autour du matériau du caillot. Utilisez une pointe de pipette stérile pour un meilleur écoulement à travers le grillage du filtre.
note: Évitez toute dilution du caillot, par exemple en lavant le caillot avec du PBS. L’urokinase agit indirectement et nécessite des composants du sérum (c’est-à-dire le plasminogène) de la biopsie pour une digestion efficace. Tout en poursuivant la procédure avec le matériau du caillot, le filtrat peut être conservé à RT jusqu’à la suite de l’utilisation à l’étape 3.6.
- Transférez le matériel de caillot de moelle osseuse dans une boîte de culture cellulaire vide à l’aide d’une pince stérile. Coupez les débris en petits morceaux d’environ 2 mm3 à l’aide d’un scalpel stérile.
- Transférez les petits morceaux du caillot dans un tube de réaction de 50 ml à l’aide de la pince stérile. Assurez-vous que le caillot haché a un aspect humide. S’il semble sec, utilisez une partie du filtrat de l’étape 3.1 pour humidifier.
- Triturez le caillot en pipetant de haut en bas 5 fois à l’aide d’une pipette à microtitration de 5 ml. Ajouter 1 aliquote d’urokinase à l’échantillon. Incuber pendant 30 min à 37 °C soit au bain-marie, soit dans un incubateur en secouant (doucement).
- Triturer en pipetant de haut en bas 5 fois à l’aide d’une pipette de 5 ml. Effectuez cette étape dans une enceinte de biosécurité. Incuber encore 30 min à 37°C. Après l’incubation, triturer à nouveau 5 fois à l’aide d’une pipette de 5 ml. Passer au-dessus d’une crépine à cellules neuves de 100 μm pour la mettre en pool avec le filtrat de l’étape 3.2.
- Centrifuger la suspension cellulaire à température ambiante pendant 10 min à 500 x g. Jeter le surnageant. Remettez la pastille en suspension dans un milieu comme décrit ci-dessous ou selon la procédure standard de votre laboratoire pour la culture d’expansion MSC.
4. Ensemencement pour la culture de cellules d’expansion et les plaques CFU
- Remettre en suspension les cellules (constituées d’érythrocytes et de cellules mononucléaires) dans 50 ml de milieu basal : Alpha-MEM complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS), 100 U/ml de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine et 2,5 mg/ml d’amphotéricine B. Compter les cellules diluées 1:10 dans une solution de Trypan Blue à l’aide d’une chambre de Neubauer.
- Placer les cellules dans des flacons de culture cellulaire à la densité de 5 x 107 cellules/cm2 et incuber dans un incubateur humidifié à 37 °C. Si possible, utilisez des conditions hypoxiques (5 % d’oxygène). Pour le contrôle du test UFC, plaquez 10à 9 cellules dans une boîte de culture cellulaire de 10 cm de diamètre.
- Après 3 jours de culture, les cellules souches mésenchymateuses sont attachées à la boîte de culture cellulaire tandis que les autres cellules restent en suspension. Changez le milieu avec un milieu basal complété par 5 ng/ml de facteur de croissance des fibroblastes basiques (bFGF). Pour le contrôle du test CFU, traitez également la boîte de culture cellulaire.
- Poursuivre la culture cellulaire pendant 2 semaines au total, en échangeant les milieux trois fois par semaine. Si les cellules dépassent 80 % de confluence, divisées par trypsinisation. Pour le contrôle du test CFU, remplacez également les milieux, mais ne divisez pas les cellules pendant les deux semaines.
5. Différenciation MSC
- Différenciation des CSM canines
note: Les CSM canines ont été différenciées en lignées chondrogéniques, ostéogéniques et adipogènes par stimulation avec les milieux appropriés pendant quatre semaines.
- Différenciation chondrogénique
- Découpez des cubes (3 mm de chaque côté) dans un dispositif médical en forme d’éponge, constitué de collagène lyophilisé de type I, et utilisé comme matériau d’échafaudage pour soutenir les cellules.
- Semez les CSM sur le dessus des cubes à la concentration de 4 x 106 cellules/ml (~70 000 cellules/cube).
- Avant d’ajouter le milieu, laissez les cellules adhérer aux cubes pendant 30 min.
- Maintenir les constructions de collagène MSC dans un milieu chondrogénique composé de DMEM/F12 + GlutaMAX, 2,5 % FBS, 100 unités/ml de pénicilline, 100 mg/ml de streptomycine, 2,5 μg/ml d’amphotéricine B, 40 ng/ml de dexaméthasone, 50 μg/ml d’acide ascorbique 2-phosphate, 50 μg/ml de L-proline, 1x insuline-transfertrine-sélénium X et 10 ng/ml de facteur de croissance transformant-β1.
- Utilisez la coloration au bleu d’alcian pour visualiser l’accumulation de protéoglycanes dans les sections de construction. Brièvement, colorez les sections O/N avec 0,4 % de bleu d’alcian dissous dans 0,01 % de H2SO4 et 0,5M de chlorhydrate de guanidine. Ensuite, lavez les sections qui ont été lavées pendant 30 min dans 40 % de DMSO et 0,05M MgCl2. Les cellules ont été contre-colorées au rouge nucléaire rapide.