Coloration Sudan IV : une procédure pour colorer les plaques d’athérosclérose chargées de lipides dans l’arc aortique de souris récolté

Résumé

Source : Centa, M., et al. Quantification de l’athérosclérose chez la souris. J. Vis. Exp. (2019)

Cette vidéo montre une procédure utilisant la coloration Sudan IV pour colorer les dépôts graisseux dans l’arc aortique de souris récolté afin de visualiser les plaques d’athérosclérose et de déterminer l’étendue de l’athérosclérose.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE

1. Analyse en face de l’arc aortique et de l’artère brachiocéphalique

1. Préparez les lits d’épinglage pour l’analyse en face des arcs aortiques. Pliez huit fois un segment de film de cire de paraffine pour obtenir une surface plane de 25 mm x 25 mm. Enveloppez-le avec du ruban isolant électrique noir pour créer un fond sombre pour l’aorte. Placez une étiquette à l’arrière du lit d’épinglage et utilisez un crayon de plomb pour écrire le numéro d’identification de la souris (l’encre normale du stylo disparaîtra lors du processus de coloration).
2. Transférez l’arc aortique sur le lit d’épinglage et placez une goutte de PBS par-dessus. Commencez à nettoyer l’aorte du tissu adipeux péri-adventice restant au microscope stéréoscopique.
   1. À l’aide de ciseaux Vannas et d’une pince Dumont, vous pouvez décoller délicatement tout le tissu adipeux environnant sans manipuler ni endommager l’aorte. Le Sudan IV colorera vivement le tissu adipeux et il est crucial d’enlever tous ces tissus à ce stade.
      note: Gardez l’aorte humide en tout temps, en appliquant du PBS supplémentaire si nécessaire.
3. Ouvrez l’aorte dans le plan coronal en introduisant les ciseaux Vannas dans la lumière aortique pour exposer la surface intimale. Commencez à couper la courbure externe de l’arc ascendant dans le sens distal et continuez à ouvrir les branches, y compris l’artère brachiocéphale. Épargnez la partie dorsale de la région thoracique descendante.
   1. Coupez la petite courbure et pliez l’aorte pour afficher la surface intimale.
      note: Cette étape nécessite une motricité fine et nécessite un peu de pratique pour être maîtrisée.
4. Épinglez l’arc ouvert au lit d’épinglage à l’aide de l’extrémité émoussée des épingles à insectes minutien. Utilisez un porte-aiguille micro Castroviejo pour mettre les broches en place. Pliez doucement les goupilles pour les éloigner de l’échantillon lorsqu’elles sont en place. Épinglez l’aorte à plat sur le lit sans étirer l’échantillon. Rangez l’arc épinglé vers le bas dans une boîte de Pétri remplie de PBS à 4 °C
   note: Le protocole peut être mis en pause ici.
5. Préparer une solution fonctionnelle de Sudan IV. Mélangez 1 g de poudre Sudan IV, 100 ml d’éthanol à 70 % et 100 ml d’acétone dans une bouteille foncée et remuez doucement pendant 10 minutes. Il n’est pas nécessaire de filtrer la solution et elle peut être utilisée pendant quelques mois si elle est maintenue à l’abri de la lumière à température ambiante. Si la couleur de coloration n’est pas satisfaisante, une nouvelle solution peut être apportée et les échantillons colorés à nouveau.
   prudence: L’acétone est un liquide inflammable qui peut provoquer une grave irritation des yeux. Stocker dans un endroit bien ventilé et prendre des mesures de précaution lors de la manipulation.
6. Disposez cinq boîtes de Pétri sur la paillasse du laboratoire : une remplie d’éthanol à 70 %, une remplie de solution de travail Sudan IV, deux remplies d’éthanol à 80 % et une remplie de PBS.
   1. Commencez par rincer l’échantillon à l’éthanol à 70 % pendant 5 minutes en plaçant le lit d’épinglage dans la première boîte de Pétri avec l’arcade vers le bas. Transférez l’échantillon dans la solution de travail Sudan IV et laissez-le tacher l’arc pendant 7 min.
   2. Ensuite, rincez deux fois à l’éthanol à 80 % pendant 3 minutes pour décolorer la surface intimale normale. Le temps de décoloration peut être ajusté pour optimiser les résultats. Enfin, rincez au PBS avant de remettre l’échantillon dans la boîte de Pétri d’origine.
7. Acquérez des micrographies à l’aide d’un stéréomicroscope à un grossissement de 10 fois connecté à un appareil photo numérique. Prenez des photos de l’arc épinglé immergé dans le PBS à l’aide de petits poids métalliques (20 mm x 10 mm x 5 mm) pour maintenir le lit d’épinglage au fond d’une boîte de Pétri.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Ruban isolant électrique noir (50 mm de large)	Tout détaillant spécialisé		Pour créer des lits d’épinglage pour les arcs aortiques.
Ciseaux de dissection (10 cm, droits)	Instruments de précision mondiaux	Référence 14393	Pour la dissection générale des organes.
Pince Dumont #5 (11 cm, droite)	Instruments de précision mondiaux	500341	Pour la microdissection de l’aorte.
Éthanol 70 % (v/v)	Produits chimiques VWR	Référence 83801.29	Liquide et vapeur hautement inflammables, à conserver dans un endroit bien ventilé et à conserver au frais.
Éthanol absolu ≥99,8 %	Produits chimiques VWR	Référence 20821.31	Liquide et vapeur hautement inflammables, à conserver dans un endroit bien ventilé et à conserver au frais.
Formaldéhyde 4 % stabilisé, tamponné (pH 7,0)	Produits chimiques VWR	Référence 9713.1	Nocif par inhalation, par contact avec la peau et par ingestion.
Isopropanol	Merck	1096341011	Liquide inflammable, provoque une irritation oculaire grave et peut provoquer de la somnolence ou des étourdissements.
Porte-aiguille Micro Castroviejo (9 cm, droit)	Instruments de précision mondiaux	503376	Pour l’épinglage des arcs aortiques.
Pinces à insectes Minutien, 0,10 mm	Outils scientifiques fins	Référence 26002-10	Pour l’épinglage des arcs aortiques.
Parafilm M	Bemis	Réf. PM992	Film de cire de paraffine utilisé pour créer des lits d’épinglage pour les arcs aortiques.
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)	-	-	Une solution stérile et sans RNase est nécessaire pour la perfusion des souris
Stéréomicroscope	Microsystèmes Leica	MZ6	Pour la dissection et la documentation en face
Soudan IV	Sigma-Aldrich	Réf. S4261	Non classé comme substance ou mélange dangereux.
Ciseaux Vannas (8 cm, droits)	Instruments de précision mondiaux	503378	Pour la microdissection de l’aorte.