Coloration de Wiesner pour visualiser la lignine : une technique pour tacher les dépôts de lignine présents dans les tiges d’Arabidopsis thaliana

Résumé

Source : Pradhan Mitra, P. et al., Coloration histochimique des éléments secondaires de la paroi cellulaire d’Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (2014).

Dans cette vidéo, nous décrivons la technique de coloration de Wiesner pour colorer la lignine présente dans des cellules végétales spécialisées. Cette technique de coloration permet de visualiser les parois cellulaires lignifiées dans les tiges d’Arabidopsis thaliana et de quantifier la lignification des parois cellulaires de différents types de cellules.

Protocole

1. Intégration des tiges

1. Préparez une solution d’agarose à 7 % dans de l’eau (7 g d’agarose de qualité électrophorèse dans 100 ml d’eau distillée). Dissoudre l’agarose à l’autoclave pendant 20 minutes ou au micro-ondes pendant 20 minutes à l’intensité la plus faible (p. ex., intensité de 10 % d’un four à micro-ondes de 1 250 watts).
2. Préparez un moule maison pour enfoncer les tiges à l’aide de flacons en plastique.
   1. À l’aide d’une lame de rasoir, coupez le fond conique d’un tube de microcentrifugation à bouchon à vis de 2 ml (partie A). À l’aide d’une aiguille de seringue, percez un trou dans le capuchon du tube légèrement plus grand que le diamètre de la tige à encastrer. Ensuite, coupez 0,5 cm du fond d’un tube de microcentrifugation de 0,6 ml (partie B).
   2. Ajoutez la partie coupée de 0,5 cm du tube de microcentrifugation de 0,6 ml dans le tube de microcentrifugation prédécoupé de 2 ml. Scellez les deux pièces à l’aide de Parafilm (Figure 1).
      note: Le fond du tube est coupé pour faciliter l’enlèvement de l’échantillon noyé après la solidification de l’agarose. Le trou dans le capuchon aidera à maintenir la tige stable lorsque la tige est incrustée dans l’agarose. Le moule servira à retenir l’agarose et à maintenir la tige droite lors de l’enrobage. Le Parafilm maintiendra les deux parties, A et B, jusqu’à ce que l’agarose soit prise et que la tige soit intégrée.
   3. À l’aide d’une lame de rasoir, coupez une section de tige dans la zone d’intérêt (par exemple, au milieu du premier entre-nœud de tige).
      note: Idéalement, la tige doit être coupée juste avant l’encastrement pour éviter la destruction par déshydratation. Alternativement, la tige peut être temporairement stockée dans une plaque contenant un papier filtre mouillé avec de l’eau. Cette plaque peut être placée sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à être encastrée pour éviter la déshydratation et la déformation des tissus. Le stockage de la tige pendant des périodes de plus de 30 minutes sans humidité élevée entraînera le dessèchement de la tige.
3. Faites fondre l’agarose au micro-ondes à faible intensité.
   prudence: Le flacon contenant l’agarose est peut-être chaud. Utilisez un gant pour ramasser la bouteille. Laissez reposer l’agarose fondue à température ambiante (entre 20 °C et 25 °C) jusqu’à ce qu’elle refroidisse à environ 50 °C.
4. Pipetez lentement 5 ml d’agarose dans le moule en plastique préfabriqué pour remplir le flacon.
   note: Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans les moules. Les bulles d’air provoqueront des trous dans le moule de l’agarose et ne couvriront pas complètement l’échantillon de tige, ce qui entraînera éventuellement une coupe inégale des sections d’échantillon.
   1. Laissez l’agarose refroidir pendant 30 à 60 secondes pour qu’elle devienne semi-solide. Testez avec un petit cure-dent, en vous assurant qu’il peut pénétrer et se tenir debout, mais pas flotter, dans l’agarose.
      note: Si la tige est placée alors que l’agarose est encore chaude, elle endommagera l’échantillon en ratatinant la tige, détruisant ainsi la morphologie cellulaire.
   2. Placez la tige dans ce flacon rempli d’agarose. Assurez-vous que la tige reste droite. Placez le capuchon perforé de manière à ce que l’extrémité de la tige soit maintenue par le capuchon. Ne tournez pas le capuchon à vis. Parfois, plus d’une tige (d’un seul type) peut être intégrée dans un seul flacon ; Mais dans ce cas, n’utilisez pas le cap.
      note: Si le capuchon à visser est tourné, la tige se tordra.
5. Laissez le flacon à température ambiante ou à 4 °C pendant 10 à 30 minutes, jusqu’à ce qu’il se solidifie.
6. Retirez le moule en le faisant glisser doucement hors du tube. Ouvrez le Parafilm. Poussez doucement le bas de la partie B du moule avec le pouce pour libérer l’agarose solidifiée de la partie A sur une lame de microscope en verre.
7. Coupez la tige incrustée d’agarose en trois morceaux à peu près égaux de 1,2 cm de longueur. Découpez la partie de la tige qui n’était pas dans l’agarose et jetez-la.
   1. Conservez ces morceaux d’agarose avec les tiges incrustées dans des tubes de microcentrifugation hermétiques de 2 ml dans une boîte sombre à 4 °C jusqu’au moment de les sectionner. Vous pouvez également stocker les tubes à 4 °C pendant une semaine au maximum.
      note: Le stockage est possible, mais l’expérimentateur doit être conscient que les tiges intégrées sont toujours vivantes et, selon l’expérience, des artefacts pourraient potentiellement être introduits.

2. Section de la tige

ATTENTION : Lisez attentivement le manuel du vibratome et suivez toutes les consignes de sécurité.

1. Assurez-vous que le disque de l’échantillon est propre et complètement sec (exempt de tout solide ou liquide). Nettoyez le disque de l’échantillon avec une lame de rasoir pour enlever tout résidu de colle des expériences précédentes et lavez-le à l’eau. Séchez ensuite avec un essuie-tout.
   note: Cela garantira que l’adhésif fonctionne bien et se lie à l’échantillon d’agarose. Si cette étape n’est pas effectuée correctement, il est possible que l’échantillon n’adhère pas au disque et qu’il fasse tomber l’échantillon du disque pendant la section.
   1. Utilisez des lingettes en papier doux pour enlever l’humidité du bloc d’agarose contenant les échantillons.
   2. Placez une petite goutte d’adhésif tissulaire sur le disque de l’échantillon. Estompez l’adhésif pour couvrir la zone au milieu de la plaque à l’aide de l’embout de la bouteille d’adhésif. Placez rapidement le bloc d’agarose de manière à ce que les éprouvettes soient perpendiculaires ou parallèles à la plaque pour les sections transversales ou longitudinales, respectivement. Laissez l’adhésif fixer l’échantillon sur le disque d’échantillon à température ambiante ou à 4 °C pendant 10 à 30 min. REMARQUE : Il s’agit d’une étape urgente.
2. Fixez le disque d’échantillon en place sur le plateau tampon ou l’auge. Le(s) bloc(s) d’agarose avec les sections doivent être parallèles à la lame du rasoir. Remplissez le bac tampon avec de l’eau distillée à température ambiante jusqu’à ce que les échantillons soient complètement immergés.
3. Coupez une lame de rasoir en deux, puis coupez les extrémités avec des ciseaux robustes pour que la lame reste complètement plate. Fixez la moitié de la lame de rasoir prédécoupée sur le porte-couteau.
   1. Réglez l’angle sur le porte-couteau à 84°, la vitesse sur 0,90 mm/sec (position 8 sur le vibratome) et la fréquence sur 50 Hz (position 5 sur le vibratome). Sections coupées de 100 μm d’épaisseur. Utilisez le mode continu. note: Cette épaisseur a été choisie pour s’assurer que le tissu peut résister aux divers traitements acides et basiques utilisés dans certains des protocoles de coloration. Réglez la fenêtre de sectionnement et comptez 15-20 min en mode continu pour que le vibratome coupe un bloc d’agarose d’environ 1,2 cm.
4. Prélevez les sections à l’aide d’une pipette en plastique jetable lors de la coupe dans le bac tampon. Alternativement, les sections peuvent être transférées du plateau tampon dans un bécher en verre, puis sur une plaque de Petri transparente. Transférez quelques sections dans les tubes de microcentrifugation de 2,0 ml. Remarque : Les échantillons sont prélevés à partir d’une plaque de Pétri car il est plus facile de voir les coupes sur un fond clair et parce que le plateau tampon peut être apprêté pour l’échantillon suivant.
5. Les sections peuvent être stockées dans un tube de 50 ml ou collectées et stockées dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 à 2 ml à 4 °C pendant 30 à 60 min
   note: Le stockage des sections pendant de longues périodes entraînera une mauvaise qualité d’image.

3. Coloration au phloroglucinol-HCl (Wiesner)

1. Dissoudre 0,3 g de phloroglucinol dans 10 ml d’éthanol absolu pour préparer une solution de phloroglucinol à 3 %. Mélanger un volume de HCl concentré (37 N) à deux volumes de phloroglucinol à 3 % dans de l’éthanol ; cette solution est le phloroglucinol-HCl (Ph-HCl) ou le colorant de Wiesner.
   note: Cette solution doit être fraîche le jour de la coloration et ne peut pas être conservée, car la solution se dégradera avec le temps et la coloration deviendra inefficace.
   prudence: Le HCl est très corrosif, alors faites preuve d’une extrême prudence lors de la manipulation de la coloration Ph-HCl.
2. Transférez les sections de tige dans un tube de microcentrifugation de 2,0 ml. Ajoutez 1 ml de solution de Ph-HCl dans le tube contenant les sections et bouchez-le immédiatement car le HCl dans la coloration au Ph-HCl est très corrosif. Déplacez doucement le tube pour vous assurer que toutes les sections sont tachées. Une alternative à cette étape consiste à garder le capuchon du tube ouvert afin que la solution de Ph-HCl puisse être pipetée de haut en bas, de préférence sans perturber les sections.
   note: Veillez à ne pas pipeter les sections dans la pointe de la pipette, car cela pourrait endommager ces sections.
   1. Utilisez une pipette de 1 ml avec la pointe de la pipette coupée de manière à ce que les sections puissent être pipetées facilement et sans dommage. Pipetez doucement des sections dans la pointe et sur une lame de microscope. Couvrez les sections avec une lamelle. Observez les sections sous un éclairage en fond clair. (Figure 2)
      note: La solution de Ph-HCl sèche en 5 à 10 minutes, provoquant une détérioration des échantillons. Par conséquent, l’imagerie doit être terminée dans ce laps de temps.

Résultats

Figure 1. Moule fait maison pour l’encastrement des tiges.Sur le côté gauche ; le haut du tube de microcentrifugation à bouchon à vis de 2 ml (partie A) et le bas du tube de microcentrifugation de 0,6 ml (partie B). Sur le côté droit ; le Parafilm tenant les deux parties ; A et B pour former le moule final.

Figu...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose	EMD	MERC2125	Numéro CAS : 9012-36-6
Le phloroglucinol	sigma	P 3502	1,3,5-trihydroxybenzène [Numéro CAS : 108-73-6]
acide chlorhydrique	EMD	Réf. HX0603-75	Numéro CAS : 7647-01-0
Éthanol 190 proof	KOPTEC	V1401	Numéro CAS : 64-17-5
Vibratome	Leica	Leica Microtome à lame vibrante VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/ produits/sectionnement/microtomes-à-lames vibrantes/détails/produit/ leica-VT1000-S/
rasoir	Entreprise américaine de rasoirs de sécurité	Article # 60-0139-0000	Lame à double tranchant en acier inoxydable (Personna Super)
Tubes à microcentrifuger à bouchon à vis (2 ml)	VWR	Référence 16466-044
Tubes de microcentrifugation (0,6 ml)	Axygen Scientific	Référence : MCT-060-C
Adhésif tissulaire	Ted Pella Inc	Référence 10033	Conserver à 4 °C ou 20 °C pendant 3 mois ou plus
Caméra avec puce CCD sans obturateur mécanique	Hamamatsu	Réf. C4742-95
Logiciel de l’appareil photo	Dispositifs moléculaires	Version 7.7.0.0 de MetaMorph
Imaginer l’anaylsis	adobe	Photoshop CS4
Verres Micro Cover, Carrés, N° 1	VWR	Référence 48366-067	22 x 22 mm (7/8 x 7/8") - Les verres sont résistants à la corrosion
Micro-lames givrées, 1 mm	VWR	Référence 48312-003	75 x 25 mm à 1 mm