Coloration Maule pour la lignine : une technique pour caractériser la distribution de la lignine dans les coupes de tiges d’Arabidopsis thaliana

Résumé

Source : Pradhan Mitra, P. et al., Coloration histochimique des éléments secondaires de la paroi cellulaire d’Arabidopsis thaliana. J. Vis. Exp. (2014).

Dans cette vidéo, nous décrivons la technique de coloration Maule pour colorer la lignine syringylique présente dans les cellules végétales spécialisées. Cette technique de coloration permet de caractériser la distribution de la lignine dans le xylème et les fibres interfasciculaires.

Protocole

1. Coloration de Mäule

1. Dissoudre 0,2 g de permanganate de potassium dans 40 ml d’eau distillée pour préparer une solution de permanganate de potassium à 0,5 %. Conserver dans une bouteille sombre à température ambiante pendant 7 jours maximum.
   1. Préparez une solution de HCl à 3,7 % en ajoutant 1 ml de HCl concentré (37 N) à 9 ml d’eau distillée (1:10). Préparez une solution fraîche de HCl à 3,7 % le jour de l’expérience. Assurez-vous que la solution mère de HCl 37 N utilisée n’est pas trop vieille. La solution concentrée d’hydroxyde d’ammonium (14,8 M) doit être conservée à 4 °C pour éviter que la molarité de la solution saturée ne diminue.
2. Transférez les sections de tige dans un tube de microcentrifugation de 2,0 ml. Ajouter 1 ml de la solution de permanganate de potassium à 0,5 % dans le tube contenant les sections.
   1. Pipetez doucement la solution de permanganate de potassium à 0,5 % de haut en bas, de préférence sans déranger les sections. Incuber pendant 2 min et répéter le pipetage. Laissez le tube de microcentrifugation reposer jusqu’à ce que toutes les sections se stabilisent.
      note: Veillez à ne pas pipeter les sections dans la pointe de la pipette car les sections pourraient être endommagées. Il peut être difficile de voir les sections de la tige car la solution est sombre, alors gardez le tube avec les sections sur le support du tube à essai et laissez-les reposer pendant 2 min.
   2. À l’aide d’une pipette de 1 ml, prélever 700 μl de solution de permanganate de potassium à 0,5 %. Ajouter 700 μl d’eau distillée pour rincer la solution de permanganate de potassium. Répétez l’opération 3 à 4 fois ou jusqu’à ce que la solution aqueuse reste claire.
   3. Jetez l’eau. Ajouter rapidement 1 ml de HCl à 3 % jusqu’à ce que la couleur brun foncé soit évacuée des sections. Cela peut se produire dans les 3 à 5 minutes ou peut nécessiter 2 lavages de 5 minutes chacun. Pipetez toute la solution de HCl à 3 % et passez immédiatement à l’étape suivante.
   4. Ajouter 1 ml de solution concentrée d’hydroxyde d’ammonium. Utilisez une pipette de 1 ml avec la pointe coupée de manière à ce que les sections puissent être pipetées facilement et sans dommage. Pipetez doucement des sections dans la pointe et sur une lame de microscope. Couvrez les sections avec une lamelle. Observez les sections sous un éclairage en fond clair. (Figure 1)
      prudence: L’hydroxyde d’ammonium étant extrêmement corrosif, il nécessite des précautions et une attention supplémentaires pour éviter de provoquer la corrosion de la platine du microscope ou de l’objectif.
      note: Les vapeurs d’hydroxyde d’ammonium peuvent embuer la lamelle, ce qui rend difficile l’observation de l’échantillon. Par conséquent, soyez très prudent avant d’ajouter la lamelle. La solution sèche en 5 à 10 minutes, de sorte que l’imagerie doit être terminée dans ce laps de temps.

Résultats

Graphique 1. Coloration de Mäule des coupes transversales de tiges d’A. thaliana. Coloration Mäule (couleur rouge) d’une section de tige sauvage d’A. thaliana montrant le dépôt normal de lignine dans les parois des fibres interfasciculaires et des cellules du xylème (A-E). Les positions de l’épiderme et du cortex (Ep), des fibres interfasciculaires (Fi), de la moelle (Pi) et du xylème (Xy) sont indiquées. Grossissements : Pan...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose	EMD	MERC2125	Numéro CAS : 9012-36-6
acide chlorhydrique	EMD	Réf. HX0603-75	Numéro CAS : 7647-01-0
Vibratome	Leica	Leica Microtome à lame vibrante VT1000S	http://www.leicabiosystems.com/ produits/sectionnement/microtomes-à-lames vibrantes/détails/produit/ leica-VT1000-S/
rasoir	Entreprise américaine de rasoirs de sécurité	Article # 60-0139-0000	Lame à double tranchant en acier inoxydable (Personna Super)
Tubes à microcentrifuger à bouchon à vis (2 ml)	VWR	Référence 16466-044
Tubes de microcentrifugation (0,6 ml)	Axygen Scientific	Référence : MCT-060-C
Adhésif tissulaire	Ted Pella Inc	Référence 10033	Conserver à 4 °C ou 20 °C pendant 3 mois ou plus
Caméra avec puce CCD sans obturateur mécanique	Hamamatsu	Réf. C4742-95
Logiciel de l’appareil photo	Dispositifs moléculaires	Version 7.7.0.0 de MetaMorph
Imaginer l’anaylsis	adobe	Photoshop CS4
Verres Micro Cover, Carrés, N° 1	VWR	Référence 48366-067	22 x 22 mm (7/8 x 7/8") - Les verres sont résistants à la corrosion
Micro-lames givrées, 1 mm	VWR	Référence 48312-003	75 x 25 mm à 1 mm
Hydroxyde d’ammonium	EMD	AX1303-6	Numéro CAS : 1336-21-6
permanganate de potassium	sigma	223468	Numéro CAS 7722-64-7