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1. Intégration de la tige
- Préparez une solution d’agarose à 7 % dans de l’eau (7 g d’agarose de qualité électrophorèse dans 100 ml d’eau distillée). Dissoudre l’agarose à l’autoclave pendant 20 minutes ou au micro-ondes pendant 20 minutes à l’intensité la plus faible (p. ex., intensité de 10 % d’un four à micro-ondes de 1 250 watts).
- Préparez un moule maison pour enfoncer les tiges à l’aide de flacons en plastique.
- À l’aide d’une lame de rasoir, coupez le fond conique d’un tube de microcentrifugation à bouchon à vis de 2 ml (partie A). À l’aide d’une aiguille de seringue, percez un trou dans le capuchon du tube légèrement plus grand que le diamètre de la tige à encastrer. Ensuite, coupez 0,5 cm du fond d’un tube de microcentrifugation de 0,6 ml (partie B).
- Ajoutez la partie coupée de 0,5 cm du tube de microcentrifugation de 0,6 ml dans le tube de microcentrifugation prédécoupé de 2 ml. Scellez les deux pièces à l’aide de Parafilm (Figure 1).
REMARQUE : Le fond du tube est coupé pour faciliter le retrait de l’échantillon noyé après la solidification de l’agarose. Le trou dans le capuchon aidera à maintenir la tige stable lorsque la tige est incrustée dans l’agarose. Le moule servira à retenir l’agarose et à maintenir la tige droite lors de l’enrobage. Le Parafilm maintiendra les deux parties, A et B, jusqu’à ce que l’agarose soit prise et que la tige soit intégrée.
- À l’aide d’une lame de rasoir, coupez une section de tige dans la zone d’intérêt (par exemple, au milieu du premier entre-nœud de tige).
REMARQUE : Idéalement, la tige doit être coupée juste avant l’enrobage pour éviter la destruction par déshydratation. Alternativement, la tige peut être temporairement stockée dans une plaque contenant un papier filtre mouillé avec de l’eau. Cette plaque peut être placée sur de la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête à être encastrée pour éviter la déshydratation et la déformation des tissus. Le stockage de la tige pendant des périodes de plus de 30 minutes sans humidité élevée entraînera le dessèchement de la tige.
- Faites fondre l’agarose au micro-ondes à faible intensité.
ATTENTION : Le flacon contenant l’agarose peut être chaud. Utilisez un gant pour ramasser la bouteille. Laissez reposer l’agarose fondue à température ambiante (entre 20 °C et 25 °C) jusqu’à ce qu’elle refroidisse à environ 50 °C.
- Pipetez lentement 5 ml d’agarose dans le moule en plastique préfabriqué pour remplir le flacon.
REMARQUE : Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air dans les moules. Les bulles d’air provoqueront des trous dans le moule de l’agarose et ne couvriront pas complètement l’échantillon de tige, ce qui entraînera éventuellement une coupe inégale des sections d’échantillon.
- Laissez l’agarose refroidir pendant 30 à 60 secondes pour qu’elle devienne semi-solide. Testez avec un petit cure-dent, en vous assurant qu’il peut pénétrer et se tenir debout, mais pas flotter, dans l’agarose.
REMARQUE : Si la tige est placée alors que l’agarose est encore chaude, elle endommagera l’échantillon en ratatinant la tige, détruisant ainsi la morphologie cellulaire.
- Placez la tige dans ce flacon rempli d’agarose. Assurez-vous que la tige reste droite. Placez le capuchon perforé de manière à ce que l’extrémité de la tige soit maintenue par le capuchon. Ne tournez pas le capuchon à vis. Parfois, plus d’une tige (d’un seul type) peut être intégrée dans un seul flacon ; Mais dans ce cas particulier, n’utilisez pas le cap.
REMARQUE : Si le capuchon à visser est tourné, la tige se tordra.
- Laissez le flacon à température ambiante ou à 4 °C pendant 10 à 30 minutes, jusqu’à ce qu’il se solidifie.
- Retirez le moule en le faisant glisser doucement hors du tube. Ouvrez le Parafilm. Poussez doucement le bas de la partie B du moule avec le pouce pour libérer l’agarose solidifiée de la partie A sur une lame de microscope en verre.
- Coupez la tige incrustée d’agarose en trois morceaux à peu près égaux de 1,2 cm de longueur. Découpez la partie de la tige qui n’était pas dans l’agarose et jetez-la.
- Conservez ces morceaux d’agarose avec les tiges incrustées dans des tubes de microcentrifugation hermétiques de 2 ml dans une boîte sombre à 4 °C jusqu’au moment de les sectionner. Vous pouvez également stocker les tubes à 4 °C pendant une semaine au maximum.
REMARQUE : Le stockage est possible, mais l’expérimentateur doit être conscient que les tiges intégrées sont toujours vivantes et, selon l’expérience, des artefacts pourraient potentiellement être introduits.
2. Section de la tige
ATTENTION : Lisez attentivement le manuel du vibratome et suivez toutes les consignes de sécurité.
- Assurez-vous que le disque de l’échantillon est propre et complètement sec (exempt de tout solide ou liquide). Nettoyez le disque de l’échantillon avec une lame de rasoir pour enlever tout résidu de colle des expériences précédentes et lavez-le à l’eau. Séchez ensuite avec un essuie-tout.
REMARQUE : Cela garantira que l’adhésif fonctionne bien et se lie à l’échantillon d’agarose. Si cette étape n’est pas effectuée correctement, il est possible que l’échantillon n’adhère pas au disque et qu’il fasse tomber l’échantillon du disque pendant la section.
- Utilisez des lingettes en papier doux pour enlever l’humidité du bloc d’agarose contenant les échantillons.
- Placez une petite goutte d’adhésif tissulaire sur le disque de l’échantillon. Estompez l’adhésif pour couvrir la zone au milieu de la plaque à l’aide de l’embout de la bouteille d’adhésif. Placez rapidement le bloc d’agarose de manière à ce que les éprouvettes soient perpendiculaires ou parallèles à la plaque pour les sections transversales ou longitudinales, respectivement. Laisser l’adhésif fixer l’échantillon sur le disque d’échantillon à température ambiante ou à 4 °C pendant 10 à 30 min
REMARQUE : Il s’agit d’une étape sensible au temps.
- Fixez le disque d’échantillon en place sur le plateau tampon ou l’auge. Le(s) bloc(s) d’agarose avec les sections doivent être parallèles à la lame du rasoir. Remplissez le bac tampon avec de l’eau distillée à température ambiante jusqu’à ce que les échantillons soient complètement immergés.
- Coupez une lame de rasoir en deux, puis coupez les extrémités avec des ciseaux robustes pour que la lame reste complètement plate. Fixez la moitié de la lame de rasoir prédécoupée sur le porte-couteau.
- Réglez l’angle sur le porte-couteau à 84°, la vitesse sur 0,90 mm/sec (position 8 sur le vibratome) et la fréquence sur 50 Hz (position 5 sur le vibratome). Sections coupées de 100 μm d’épaisseur. Utiliser le mode continu.
REMARQUE : Cette épaisseur a été choisie pour s’assurer que le tissu peut résister aux divers traitements acides et basiques utilisés dans certains des protocoles de coloration. Réglez la fenêtre de sectionnement et comptez 15-20 min en mode continu pour que le vibratome coupe un bloc d’agarose d’environ 1,2 cm.
- Prélevez les sections à l’aide d’une pipette en plastique jetable lors de la coupe dans le bac tampon. Alternativement, les sections peuvent être transférées du plateau tampon dans un bécher en verre, puis sur une plaque de Petri transparente. Transférez quelques sections dans les tubes de microcentrifugation de 2,0 ml.
REMARQUE : Les échantillons sont prélevés à partir d’une plaque de Petri car il est plus facile de voir les coupes sur un fond clair et parce que le plateau tampon peut être amorcé pour l’échantillon suivant.
- Les sections peuvent être stockées dans un tube de 50 ml ou collectées et stockées dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 à 2 ml à 4 °C pendant 30 à 60 min
REMARQUE : Le stockage des sections pendant de longues périodes entraînera une mauvaise qualité d’image.
3. Coloration blanche au calcofluor
- Dissoudre 0,02 g d’azurant 28 (blanc calcofluor M2R) dans 10 ml d’eau distillée pour préparer une solution mère à 0,2 %. La solution à 0,2 % peut être conservée pendant six mois dans un flacon sombre à 4 °C. Préparez une solution de travail à 0,02 % en diluant 10 fois la solution mère à 0,2 % avec de l’eau distillée.
- Transférez les sections de tige dans un tube de microcentrifugation de 2,0 ml. Ajouter dans le tube 1 ml de la solution de blanc de calcofluor à 0,02 %. Pipetez doucement la solution de blanc de calcofluor à 0,02 % de haut en bas.
REMARQUE : Veillez à ne pas pipeter les sections dans la pointe de la pipette car cela pourrait endommager les sections.
- Incuber à température ambiante pendant 5 min et répéter le pipetage. Incuber la section pendant encore 3 minutes à température ambiante.
REMARQUE : Laissez les sections se déposer sur le fond du tube pour faciliter le pipetage de la solution sans endommager les sections.
- À l’aide d’une pipette de 1 ml, prélever 700 μl de solution de blanc de calcofluor à 0,02 % et ajouter 700 μl d’eau distillée ; attendre 5 min pour rincer la solution de blanc de calcofluor. Répétez le lavage 3-4 fois. Utilisez une pipette de 1 ml avec la pointe de la pipette coupée de manière à ce que les sections puissent être pipetées facilement sans dommage.
- Pipetez doucement des sections dans la pointe et sur une lame de microscope et couvrez-les d’une lamelle. Observez les sections sous la lumière UV.
