Purification de protéines par chromatographie échangeuse d’anions : technique de séparation pour isoler une protéine d’intérêt d’un lysat bactérien dialysé sur la base de la charge nette

Résumé

Source : Fuehner, S., et al. Purification du S100A12 humain et de ses oligomères induits par les ions pour la stimulation des cellules immunitaires J. Vis. Exp. (2019)

Dans cette vidéo, nous démontrons une technique de chromatographie par échange d’anions pour purifier les protéines humaines liant le calcium S100A12 basée sur la charge de surface nette de la protéine provenant d’une culture d’Escherichia coli.

Protocole

1. Purification des protéines

1. Chromatographie par échange d’anions
   1. dialyse
      1. Préparez le tampon A de chromatographie par échange d'anions (AIEX) en dissolvant 20 mM de Tris, 1 mM d'EDTA et 1 mM d'éthylène glycol-bis(2-aminoéthylétre)-N, N, N', N'-acide tétraacétique (EGTA) dans de l'eau désionisée et ajustez le pH à 8,5 avec du HCl. Pour la dialyse, préparer 2 x 5 L et pour la chromatographie 2 x 1 L de tampon AIEX A.
         note: Le volume du dialysat doit être d’environ 100 fois le volume de l’échantillon. Tous les tampons utilisés pour la chromatographie doivent être filtrés (0,45 μm ou moins) et dégazés (par exemple, par bain d’ultrasons ou dégazage sous vide).
      2. Coupez la tubulure de dialyse (seuil de coupure de la masse moléculaire [MWCO] : 3,5 kDa) à une longueur appropriée avec un espace supplémentaire pour l’air afin d’assurer la flottabilité de l’échantillon au-dessus de la barre d’agitation rotative.
         note: Le glycérol préserve la membrane et doit être retiré avant utilisation.
      3. Pour réduire la viscosité de la solution protéique clarifiée, diluer la solution avec 25 mL de tampon A AIEX pour faciliter l’application ultérieure sur la colonne de chromatographie. Fixez le premier bouchon sur le tube, chargez l’échantillon dans la membrane et fixez le deuxième bouchon à au moins 1 cm de l’extrémité supérieure du tube.
      4. Placez le récipient de 5 L avec le tampon AIEX A sur une plaque d’agitation, ajoutez une barre d’agitation et la membrane remplie de solution protéique. Ajustez la vitesse de rotation de l’échantillon en évitant les interférences avec le barreau d’agitation en rotation. Dialyser pendant 12 à 24 h à 4 °C, puis remplacer le tampon de dialysat (tampon AIEX A) par une préparation fraîche pré-refroidie et continuer pendant au moins 4 heures supplémentaires. Transvaser la solution protéique dialysée dans un tube de 50 mL et filtrer à travers une unité de filtration de 0,45 μm.
         note: Stockage possible.
   2. chromatographie
      1. Démarrez le système de chromatographie liquide (FPLC) avec la maintenance générale, connectez les tampons de colonne AIEX A et AIEX B (tampon AIEX A avec 1 M de NaCl) et la colonne contenant de la résine échangeuse d’anions. Reportez-vous au Tableau 1 pour les paramètres chromatographiques généraux.
         note: Les tampons, la colonne et l’équipement FPLC doivent être équilibrés à la même température avant de commencer le cycle (voir les paramètres chromatographiques dans le tableau 1 et le tableau 2).
      2. Équilibrez la colonne avec le tampon AIEX A, chargez ensuite l’échantillon sur la colonne et éluez les protéines avec un gradient linéaire de 0 % à 100 % de tampon à haute teneur en sel (AIEX B). Voir le tableau 2 pour un protocole de méthode détaillé.
      3. Prélever 2 mL de fractions pendant l’élution et analyser 10 μL de chaque fraction sur une électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium à 15 % (SDS-PAGE) tachée de Coomassie. Regrouper les fractions contenant S100A12 protéine pour la dialyse.
         note: Le poids moléculaire de S100A12 est de 10 575 Da.

Résultats

Tableau 1 : Informations détaillées sur les paramètres appliqués à la chromatographie par échange d’anions.

Volume du lit (CV)	75 ml
moniteur	Absorbance à 280 nM
Pression maximale	3 bar
Tampon de colonne A	20 mM de Tris-HCl, 1 mM d’EDTA, 1 mM d’EGTA, pH 8,...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
25 % HCl  ;	Carl Roth  ;	X897.1
4&moins ; 20 % Mini-PROTEAN TGX Gels Protéinés  ;	BioRad  ;
Coomassie Briliant Blue R250 Solution de décoloration	BioRad  ;
Coomassie Briliant Blue R250 Solution de coloration  ;	BioRad  ;
EDTA sel disodique dihydraté	Carl Roth  ;	8043.1
EGTA  ;	Carl Roth  ;	3054.3
Q Sepharose Fast Flow  ;	GE Healthcare  ;	17-0510-01  ;	Résine pour la chromatographie par échange d’anions
Chlorure de sodium (NaCl)  ;	Carl Roth  ;	3957.2
Hydroxyde de sodium  ;	Carl Roth	; P031.1
Base Tris  ;	Carl Roth  ;	4855.3
0,45 et micro ; Filtre à seringue M  ;	Merck  ;
SLHA033SS bécher doseur de 5 L	Carl Roth  ;	CKN3.1
50 mL tubes à centrifuger coniques  ;	Corning  ;
Bouchons de tubulure de dialyse  ;	Spectre  ;
Tubes collecteurs de fractions 5 mL  ;	Greiner  ;
Spectra/Membrane de dialyse Por (3,5 kDa)	Spectre  ;
unité de filtration Steritop  ;	Merck  ;	SCGPT01RE
Ä ; Purificateur KTA UPC 10	; GE Healthcare  ;		du système FPLC
;	GE Healthcare  ;	Frac-920
Mini Tetra Cell Protéiforme  ;	BioRad  ;	1658000EDU
NanoPhotomètre  ;	Implen  ;	P330
pH-mètre  ;	Bibelot	765