Chromatographie d’interaction hydrophobe dépendante du calcium : une technique de purification des protéines de liaison au calcium basée sur des interactions hydrophobes

Résumé

Source : Fuehner, S., et al., Purification de la S100A12 humaine et de ses oligomères induits par les ions pour la stimulation des cellules immunitaires. J. Vis. Exp. (2019).

Dans cette vidéo, nous démontrons la purification d’une protéine de liaison au calcium à partir d’un lysat cellulaire dialysé par chromatographie d’interaction hydrophobe dépendante du calcium. Les protéines de liaison au calcium exposent une région hydrophobe lors de la liaison avec le calcium, facilitant l’interaction avec un groupe hydrophobe sur la résine. Plus tard, ces protéines sont éluées à l’aide d’un chélateur de calcium EDTA qui inverse l’interaction.

Protocole

1. Chromatographie d’interaction hydrophobe (HIC) dépendante du calcium)

1. dialyse
   1. Dialyser la solution protéique contre 20 mM de Tris, 140 mM de NaCl, pH 7,5
2. chromatographie
   1. Préparez 1 L de tampon de chromatographie HIC A en dissolvant 20 mM de Tris, 140 mM de NaCl et 25 mM de CaCl2 dans de l’eau désionisée et ajustez le pH à 7,5. Pour le tampon HIC B, dissoudre 20 mM de Tris, 140 mM de NaCl et 50 mM d’EDTA. Ajustez le pH à 7,0 et filtrez et dégazez les tampons. Ajouter le CaCl2 à l’échantillon jusqu’à une concentration finale de 25 mM et filtrer à 0,45 μm. Équilibrez les tampons HIC et l’échantillon à 4 °C (température de colonne).
   2. Démarrez le système de chromatographie liquide avec l’entretien général, connectez les tampons de colonne HIC A et B et la colonne. Reportez-vous au Tableau 1 pour plus de paramètres chromatographiques.
   3. Équilibrez la colonne, chargez l’échantillon et étendez le bloc « échantillon non lié » jusqu’à ce que le signal UV atteigne à nouveau le niveau de base. Commencer ensuite l’élution avec un chélateur de calcium contenant un tampon (EDTA). Reportez-vous au Tableau 2 pour un protocole de méthode détaillé.
      note: Des expériences antérieures ont montré qu’un excès de calcium semble être bénéfique pour la liaison de l’S100A12 à la résine de chromatographie.
   4. Prélever des fractions de pointe de 2 mL et analyser 10 μL de chaque fraction sur une SDS-PAGE à 15 % colorée à Coomassie. Mettre en pool des fractions de S100A12 pure et les dialyser contre une solution saline tamponnée à Hepes (HBS ; 20 mM Hepes, 140 mM NaCl, pH 7,0).
      note: Le coefficient d’extinction de la S100A12 monomère est de 2980 M-1 cm-1.

Résultats

Tableau 1 : Informations détaillées sur les paramètres appliqués à la chromatographie d’interaction hydrophobe.

bloquer	volume	tampon	débouché
équilibration	Volumes de 1 à 2 colonnes (CV)	un	gaspiller

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
chimique
EDTA sel disodique dihydraté	Carl Roth	Référence 8043.1
Phénylsépharose haute performance	GE Soins de santé	Référence 17-1082-01	Résine pour chromatographie d’interaction hydrophobe
Chlorure de sodium (NaCl)	Carl Roth	Référence 3957,2
hydroxyde de sodium	Carl Roth	Réf. P031.1
Base Tris	Carl Roth	4855,3
25 % HCl	Carl Roth	X897.1
Calciumchlorure dihydrat	Carl Roth	Référence 5239.1
Matériel de laboratoire
Filtre à seringue 0,45 μm	Merck	SLHA033SS
Tubes à fond rond de 14 mL	Bd	352059
Fiole Erlenmyer de 2 L	Carl Roth	LY98.1
Tubes collecteurs de fractions 5 mL	Greiner	115101
Membrane de dialyse Spectra/Por (3,5 kDa)	spectre	132724
Unité de filtration Steritop	Merck	SCGPT01RE
équipement
Collecteur de fractions	GE Soins de santé	Frac-920