Purification de protéines basée sur la chromatographie d’affinité du nickel : une technique pour purifier des protéines recombinantes marquées à la polyhistidine à partir d’un lysat de cellules bactériennes

Résumé

Source : Pokhrel, A. et al. A Purification et Activité In Vitro pour une (p)ppGpp Synthetase de Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (2018)

Dans cette vidéo, nous démontrons la technique de chromatographie d’affinité au nickel pour purifier les enzymes pyrophosphokinases marquées à l’histidine des bactéries Clostridium difficile.

Protocole

1. Purification des protéines par chromatographie d’affinité au nickel

1. Purifier les protéines à l’aide de 1 mL de résine de nickel-acide nitriloacétique (Ni-NTA) sur une colonne gravitaire.
   1. La veille de l’utilisation, équilibrer la colonne pendant la nuit à 4 °C avec 2 mL de tampon d’équilibrage (10 mM Tris-HCl pH 7,79, 300 mM NaCl, 50 mM NaH₂PO₄, 0,5 mg/mL lysozyme, 5 mM MgCl₂, 10 mM imidazole, 0,25 mM DTT, 5 mM de fluorure de phénylméthane sulfonyle (PMSF), 10 % de glycérol).
   2. Le lendemain, amenez la colonne de 4 °C à RT avant de charger le lysat clarifié et laissez-la reposer pendant ~2–3 h.
      note: Il est crucial d’amener la colonne à l’équilibre thermique pour éviter la formation de bulles d’air à l’intérieur de la colonne.
   3. Remettre la pastille en suspension dans le tampon de lyse (10 mM Tris-HCl pH 7,8, 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄, 10 % de glycérol, 0,5 mg/mL de lysozyme, 10 mM d’imidazole, 0,25 mM de DTT et 5 mM de PMSF).
   4. Sonicer les cellules sur de la glace pendant 8 x 10 s d’intervalle, en faisant une pause de 30 s entre les impulsions.
   5. Clarifier le lysat par centrifugation à 3 080 x g pendant 30 min à 4 °C à l’aide d’une microcentrifugeuse.
   6. Préparez le lysat avec des volumes égaux de tampon de lyse, puis appliquez le lysat clarifié préparé sur la colonne et recueillez le flux.
   7. Réappliquez le flux de lysat clarifié sur la colonne et récupérez le flux secondaire.
   8. Laver la colonne avec le tampon de lavage 1 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄, 30 mM imidazole, 10 % glycérol). Récupérez le fichier flow-through.
      REMARQUE : L’inclusion de 5 mM de MgCl₂ dans les tampons de lavage et d’élution est importante pour l’activité enzymatique de la protéine purifiée.
   9. Laver la colonne avec le tampon de lavage 2 (10 mM Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM NaCl, 5 mM MgCl₂, 50 mM NaH₂PO₄ et 50 mM imidazole).
   10. Récupérez le flux continu.
   11. Appliquer 2 mL de tampon d’élution (10 mM de Tris-HCl (pH 7,79), 300 mM de NaCl, 50 mM de NaH₂PO₄, 10 % de glycérol et 75 mM d’imidazole). Recueillir les échantillons en deux fractions de 1 mL chacune.
       note: Après cette étape, la colonne peut être stockée dans un tampon d’équilibrage à 4 °C si la même protéine sera purifiée lors du prochain test de purification. La colonne peut être utilisée jusqu’à 3 fois si elle est stockée correctement.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Résine Ni-NTA	G Biosciences	786-940/941
Colonnes jetables Pierce Gravity, 10 mL	Thermo Scientific	Référence 29924
Appareil de dialyse Spectra/ Por float-A-lyzer G2 de 1 mL (MWCO : 20 kD)	spectre	G235033
Processeur à ultrasons	Sonics	VC-750
Microcentrifugeuse avec rotor D3024/D3024R	Scilogex