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Toutes les procédures impliquant des modèles animaux ont été examinées par le comité institutionnel local de protection des animaux et le comité d’examen vétérinaire JoVE.
1. Extraction des lipides totaux non covalents des mycobactéries (Figure 1)
- Grattez 0,2 g de mycobactéries d’un milieu solide et ajoutez-les dans un tube en verre avec des bouchons à vis en polytétrafluoroéthylène (PTFE). Ajoutez une solution composée de 5 ml de chloroforme et de 10 ml de méthanol (chloroforme :méthanol, 1:2).
note: Lorsque des solvants organiques sont utilisés, seul un récipient en verre doit être utilisé. Aucun contenant en plastique n’est autorisé. De plus, des bouchons à vis en PTFE pour bouteilles sont nécessaires.
prudence: Le chloroforme est une substance potentiellement toxique et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
prudence: Le méthanol est une substance potentiellement toxique et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
- Laissez le tube en agitation constante pendant la nuit pour extraire les lipides non liés à la covalente de la surface des cellules mycobactériennes.
note: Si une plate-forme d’agitation orbitale n’est pas disponible, l’agitation constante peut être remplacée par une agitation manuelle périodique aussi souvent que possible.
- Couvrez un entonnoir en verre avec un papier filtre, filtrez les solvants organiques et recueillez-les dans un tube en verre.
- Utilisez un flux d’azote gazeux pour évaporer la phase liquide dans le tube. Remplissez le tube d’azote gazeux, couvrez-le et stockez-le à 4 °C
note: Connectez une pipette Pasteur en verre au flux d’azote gazeux pour évaporer spécifiquement le tube souhaité. De plus, maintenez le tube à l’intérieur d’un chauffe-moteur sec pour tubes à 37 °C. Lorsque le solvant s’évapore, remplissez le tube d’azote gazeux avant de le fermer.
- Ajouter 15 ml d’une solution de chloroforme :méthanol (2:1) aux débris cellulaires. Laissez le tube en agitation constante pendant la nuit pour extraire les lipides non liés à la covalente de la surface des cellules mycobactériennes.
note: Si une plate-forme d’agitation orbitale n’est pas disponible, l’agitation constante peut être remplacée par une agitation manuelle périodique aussi souvent que possible.
- Laissez reposer le mélange pendant 1 h. A l’aide d’une pipette Pasteur, récupérez les solvants organiques. Couvrez un entonnoir en verre avec un papier filtre et filtrez les solvants organiques et collectez-les dans le même tube en verre précédemment utilisé à l’étape 1.3. Utilisez un flux d’azote gazeux pour évaporer la phase liquide dans le tube. Remplissez le tube d’azote gazeux, fermez-le et stockez-le à nouveau à 4 °C.
2. Extraction de l’acide mycolique par méthanolyse acide (Figure 2A)
- Ajouter 2 à 5 mL de solution estérifiante dans un tube de verre hermétique avec un bouchon à vis de doublure en PTFE. Ajouter 0,2 g de biomasse mycobactérienne dans le tube de verre.
note: La solution estérifiante est formée en mélangeant 30 mL de méthanol, 15 mL de toluène et 1 mL d’acide sulfurique. Les cellules mycobactériennes peuvent être prélevées à partir de cultures solides ou, même, de cellules délipidées après extraction des lipides totaux non covalents des mycobactéries (cellules restantes après filtrage à l’étape 1.6).
prudence: Le toluène est une substance inflammable et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
prudence: L’acide sulfurique est une substance corrosive et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
- Mélangez le contenu par vortex. Laissez reposer le mélange dans un bain sec à 80 °C pendant la nuit.
- Laissez le tube refroidir jusqu’à ce qu’il atteigne la température ambiante, puis ajoutez 2 ml de n-hexane dans le tube. Mélangez le contenu en tourbillonnant pendant 30 s et laissez le tube se déposer jusqu’à ce que deux phases claires apparaissent.
ATTENTION : le n-hexane est une substance potentiellement inflammable, irritante, dommageable pour l’environnement et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
- Récupérer la phase supérieure correspondant à la phase n-hexane. Transférez-le dans un nouveau tube.
- Répétez l’étape 2.3. Récupérez à nouveau la phase supérieure et transférez-la dans le même tube que celui utilisé à l’étape 2.4.
- Évaporez le contenu du tube à l’aide d’un flux d’azote gazeux. Remplissez le tube d’azote gazeux, fermez-le et stockez-le à 4 °C.
3. Extraction de l’acide mycolique par saponification et méthylation (Figure 2B)
- Grattez 0,2 g de mycobactéries d’un milieu solide et ajoutez-les dans un tube en verre avec un bouchon à vis en PTFE.
- Ajouter 2 ml de solution de méthanol-benzène (80:20) contenant 5 % d’hydroxyde de potassium. Mélangez le contenu par vortex. Chauffer le mélange pendant 3 h à 100 °C.
prudence: Le benzène est une substance inflammable, cancérigène et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
- Laissez le tube refroidir à température ambiante. Ajouter 20 % d’acide sulfurique pour acidifier les échantillons afin d’atteindre pH = 1.
- Ajouter 3 mL d’éther diéthylique. Mélangez délicatement le contenu en tourbillonnant.
- Laissez les deux phases se former en débourbant. Récupérer la phase d’éther diéthylique et transférer dans un nouveau tube. Répétez l’étape de lavage pour un total de trois fois.
- Lavez l’extrait d’éther diéthylique avec 2 mL d’eau distillée et transférez la partie supérieure correspondant à l’éther diéthylique dans un nouveau tube. Répétez l’étape de lavage pour un total de trois fois.
- Ajoutez 2 g de sulfate de sodium anhydre sur l’extrait d’éther diéthylique pour le sécher.
- Filtrez la suspension. Évaporer le contenu à l’aide d’un flux d’azote gazeux.
- Pour effectuer l’étape de méthylation, dissoudre 3 g de N-nitroso-N-méthylurée dans une solution prérefroidie formée de 45 mL d’éther diéthylique et de 9 mL de KOH à 40 % dans de l’eau distillée.
prudence: La N-nitroso-N-méthylurée est une substance toxique, irritante, cancérigène et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
- Transvaser le surnageant (diazométhane) dans une fiole neuve refroidie dans de la glace contenant des pastilles d’hydroxyde de potassium (environ 30 g).
note: Si le surnageant n’est pas utilisé immédiatement, il peut être stocké à -20 °C pendant un maximum de 1 h
prudence: Les granulés d’hydroxyde de potassium sont une substance irritante et corrosive. Ce matériau doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
prudence: Le diazométhane est hautement toxique et potentiellement explosif. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire avec du verre de sécurité avec un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
- Ajouter 2 mL de la solution d’éther contenant du diazométhane, obtenue à l’étape 3.10, dans l’extrait d’éther diéthylique séché contenant des acides mycoliques, obtenu à l’étape 3.8. Incuber 15 min à température ambiante.
- Évaporez la suspension à 40 °C. Remplissez le tube d’azote gazeux, fermez-le et stockez les lipides méthylés à 4 °C.
note: Évaporez le diazométhane de la solution d’éther sous la hotte à flux laminaire, jusqu’à ce que l’éther perde sa couleur jaune.
4. Analyse par chromatographie sur couche mince (CCM)
- Saturez la chambre TLC en verre. Pour ce faire, recouvrez l’une des parois de la chambre TLC d’un morceau de papier filtre et laissez-le être en contact avec la phase mobile composée du mélange de solvants. Placez le volume restant du solvant au fond de la chambre CCM.
note: Le fond de la chambre de CCM doit être recouvert d’au moins 1 cm de la phase mobile. Dans les expériences actuelles, différentes phases mobiles ont été utilisées pour développer les TLC. Ils étaient constitués de 85 ml de n-hexane et de 15 ml d’éther diéthylique ; 100 mL de dichlorométhane ; 90 mL de chloroforme, 10 mL de méthanol et 1 mL d’eau ; 30 mL de chloroforme, plus 8 mL de méthanol et 1 mL d’eau ; 60 mL de chloroforme, plus 35 mL de méthanol et 8 mL d’eau ; 95 mL de chloroforme plus 5 mL de méthanol ; et 90 mL d’éther de pétrole (60-80 °C) plus 10 mL d’éther diéthylique.
note: Dans la CCM bidimensionnelle, utilisez trois fois le n-hexane :acétone (95:5) dans la première direction, et utilisez un seul développement avec le toluène :acétone (97:3) dans la deuxième direction pour analyser la composition en acide mycolique. Pour analyser les MIP, utilisez une fois chloroforme :méthanol :eau (60:30:6) dans la première direction, et utilisez chloroforme :acide acétique :méthanol :eau (40:25:3:6) dans la deuxième direction. Pour analyser le PDIM et l’AG, utilisez trois fois l’éther de pétrole (60-80 °C) :acétate d’éthyle (98:2) dans la première direction, et utilisez un seul développement avec l’éther de pétrole (60-80 °C) :acétone (98:2) dans la deuxième direction.
prudence: L’éther diéthylique est une substance potentiellement toxique et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
prudence: Le dichlorométhane est une substance potentiellement toxique et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
prudence: L’éther de pétrole est une substance potentiellement inflammable, dommageable pour l’environnement et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
prudence: L’acide acétique est une substance potentiellement inflammable et corrosive. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
prudence: L’acétate d’éthyle est une substance inflammable et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
prudence: L’acétone est une substance inflammable et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
- Fermez la chambre TLC pour la saturer pendant au moins 20 min. Pendant ce temps, dissoudre les lipides présents dans le tube de verre dans 0,2 à 1 mL de chloroforme.
note: Le volume utilisé pour dissoudre les lipides peut être modifié en fonction de la concentration souhaitée ou attendue de l’échantillon.
- Appliquez 10 μL de chaque suspension à l’aide d’un tube en verre capillaire directement sur la plaque CCM et laissez sécher l’échantillon pendant 5 min à température ambiante.
note: Les échantillons doivent être appliqués sur la partie inférieure de la plaque en laissant 1 cm de chaque côté. Les échantillons doivent être séparés les uns des autres sur au moins 0,5 cm. Une fois l’échantillon appliqué sur la plaque, les tubes peuvent être à nouveau évaporés avec de l’azote gazeux et stockés à 4 °C pour une utilisation ultérieure.
- Insérez la plaque dans la chambre CCM saturée contenant la phase mobile. Autoriser la phase mobile à s’exécuter via TLC.
note: Tout mouvement appliqué à la chambre CCM affecte le solvant en marche sur la plaque et affecte la mobilité des lipides. Dans le cas de la réalisation d’une CCM bidimensionnelle, deux chambres CCM sont nécessaires pour contenir les deux systèmes d’élution.
- Retirez la plaque de la chambre CCM lorsque le solvant atteint une distance de 1 cm de l’extrémité supérieure de la plaque. Laissez la plaque sous flux laminaire jusqu’à ce que la silice soit totalement sèche.
note: Dans le cas de l’analyse de la composition de l’acide mycolique, à l’aide de n-hexane et d’éther diéthylique (85:15), répétez les étapes 4.4 et 4.5 deux fois de plus, jusqu’à ce que la phase mobile passe trois fois sur la plaque de CCM.
- Révélez la plaque avec la teinture requise et chauffez la plaque si nécessaire.
note: Dans la présente expérience, 15 à 20 mL des solutions suivantes ont été utilisés pour pulvériser les plaques de CCM : 10 % d’hydrate d’acide molybdatophosphorique dans de l’éthanol jusqu’à ce que la plaque soit jaune vif, suivie d’un chauffage de la plaque à 120 °C ; 5 % dans l’éthanol de 20 % de α-naphtol dans l’acide sulfurique suivi d’un chauffage de la plaque à 120 °C ; Réactif bleu de molybdène (1,3 % d’oxyde de molybdène dans de l’acide sulfurique 4,2 M) jusqu’à l’apparition de bandes de phosphate ou 1 % d’anthrone dans l’acide sulfurique.
prudence: L’hydrate d’acide molybdatophosphorique est une substance inflammable et corrosive. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
prudence: L’éthanol est une substance potentiellement inflammable et dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
ATTENTION : Le 1-naphtol est une substance inflammable, corrosive et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
prudence: Le réactif de pulvérisation de bleu de molybdène est une substance corrosive, toxique et extrêmement dangereuse. Il doit être utilisé dans une hotte à flux laminaire en portant un équipement de protection individuelle approprié (blouse de laboratoire, lunettes de protection et gants en nitrile).
