$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Préparation du système de chromatographie
- Préparez le système de chromatographie en rinçant séquentiellement les conduites d’échantillon et de tampon avec de l’eau stérile, de l’hydroxyde de sodium 1 N, de l’eau et un tampon de lavage (tampon de phosphate de sodium de 20 mM contenant 150 mM de chlorure de sodium, pH 7,0) à un débit linéaire de 50 mL/min.
- Préparez une colonne d’héparine de 50 μm (10 × 10 cm, 7,9 mL de volume de colonne (CV)) en faisant fonctionner séquentiellement un tampon de nettoyage de colonne (5 CV stérile de 20 mM de phosphate de sodium contenant 2 M de chlorure de sodium, pH 7,0) et 5 CV de tampon de lavage à un débit linéaire de 7 mL/min.
2. Purification du vecteur de baculovirus
- Configurez le système de chromatographie comme suit :
- Utilisez l’orifice d’entrée de chargement de l’échantillon pour charger le surnageant de baculovirus.
- Utilisez l’orifice d’entrée du tampon A1 pour charger le tampon de lavage. Préparez une bouteille avec au moins 500 ml de tampon de lavage et placez la ligne de tampon de lavage dans la bouteille.
- Utilisez l’orifice d’entrée du tampon A2 pour le chargement du tampon d’élution (20 mM de phosphate de sodium avec 1,5 M de chlorure de sodium, pH 8,0). Préparez une bouteille contenant au moins 500 ml de tampon d’élution et placez la ligne de tampon d’élution dans la bouteille.
- Insérer plusieurs tubes coniques de 50 mL dans le collecteur de fractions pour recueillir le surnageant du baculovirus de passage en colonne, le tampon de lavage et le baculovirus élué.
- Équilibrez la colonne d’héparine avec cinq volumes de colonne (CV) de 7,9 mL de tampon de lavage (40 mL) à un débit linéaire de 7,0 mL/min.
- Charger 250 mL de surnageant du baculovirus sur la colonne d’héparine à l’aide de la pompe d’échantillonnage (orifice d’entrée de l’échantillon) du système de chromatographie à un débit linéaire de 2,0 mL/min.
- Faites passer 10 CV (80 ml) de tampon de lavage dans une colonne d’héparine à un débit linéaire de 2,0 ml/min jusqu’à ce que la courbe d’absorbance des ultraviolets (UV) (280 nm) soit revenue à la ligne de base et devienne stable.
- Éluer les particules du baculovirus de la colonne d’héparine de 7,9 mL avec 5 CV (40 mL) de tampon d’élution à un débit linéaire de 4,0 mL/min. Surveillez l’apparition d’un pic d’élution brutal de la protéine sur le chromatogramme lorsque les particules du baculovirus se dissocient de la colonne d’héparine.
- Après l’élution, diluer immédiatement 10 fois le surnageant du baculovirus élué à l’aide d’un tampon de phosphate de sodium de 20 mM dans l’eau pour empêcher l’inactivation des particules de baculovirus par choc osmotique lors de la centrifugation ultérieure.