Chromatographie échangeuse de cations : technique d’isolement d’une protéine recombinante cible à partir d’un lysat de cellule d’insecte sur la base de la charge de surface nette

Résumé

Source : Agamasu, C. et al. Entièrement transformé recombinant KRAS4b : Isolement et caractérisation de la protéine farnésylée et méthylée. J. Vis. Exp. (2020)

Cette vidéo présente la technique de chromatographie d’échange de cations permettant d’isoler la protéine recombinante du lysat de protéine de cellule d’insecte.

Protocole

1. Purification des protéines

1. Préparez les tampons A à H, comme indiqué dans le Tableau 1.

solution tampon	Agent tampon (tous les 20 mM)	pH	NaCl (mM)	Imidazole (mM)	MgCl2	Le PTCE
un	HEPES	7.3	300	-	5	1
L	HEPES	7.3	300	35	5	1
L	HEPES	7.3	300	500	5	1
D	MES	6,0	200	-	5	1
L	MES	6,0	-	-	5	1
L	MES	6,0	100	-	5	1
L	MES	6,0	1000	-	5	1
H	HEPES	7.3	300	-	1	1

2. Préparez les matériaux de purification (voir le tableau des matériaux) : cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTA ou autres chélateurs ; colonne de chromatographie d’affinité métallique immobilisée (IMAC) ; colonne de chromatographie échangeuse de cations (CEX) ; filtre de seringue de 0,45 μm ; 2 M d’imidazole (pH = 7,5) ; ultracentrifugeuse d’une capacité de 100 000 x g ; centrifugeuse de paillasse à grande vitesse d’une capacité de 4 000 x g; unités de filtration centrifuge (10 KDa NMWL) ; spectrophotomètre capable de lire à 280 nm ; Protéase du virus de gravure du tabac (TEV) ; et des instruments de chromatographie capables de mélanger deux solutions tampons, d’appliquer des solutions sur des colonnes, de créer des élutions de gradient à partir de colonnes et de collecter des fractions à partir de colonnes.
3. Retirer le lysat de cellules d’insectes de la dialyse et centrifuger à 4 000 x g pendant 10 minutes pour éliminer tout précipité. À ce stade, l’échantillon final dialysé et clarifié est encore souvent flou, mais peut être appliqué sans traitement supplémentaire sur la colonne CEX suivante.
4. Préparer une colonne d’échange cationique de 20 mL (voir Tableau des matériaux) par lavage avec trois CV de tampon G, puis avec trois CV de tampon F.
   note: Bien que nous n’ayons pas méticuleusement évalué d’autres résines, plusieurs collègues ont constaté une mauvaise résolution avec des résines autres que la résine SP Sepharose High Performance.
5. Diluer 20 mL de l’échantillon dialysé jusqu’à une concentration finale de NaCl de 100 mM en ajoutant 20 mL de tampon E et appliquer l’échantillon dilué dans la colonne d’échange cationique.
6. Continuez à charger la colonne en ajoutant des échantillons fraîchement dilués préparés comme décrit ci-dessus dans le tube de charge lorsque la dilution précédente approche de la fin de la charge.
   note: La dilution de l’échantillon entier à 100 mM de NaCl a entraîné une perte significative de protéine cible due à la précipitation.
7. Lavez la colonne jusqu’à la ligne de base Abs280 avec le tampon F. Cela nécessite généralement 3 CV. La protéine est éluée de la colonne au cours d’un gradient de 400 mL (20 CV) entre le tampon F et le tampon G à 65 %, recueilli en fractions de 6 mL (figure 1B).
8. Continuez à laver la colonne pour obtenir 1,5 CV supplémentaire (65 % de tampon G) une fois la pente terminée.

Résultats

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes Safe-Lock de 1,8 ml, naturel	Eppendorf	22363204
Flacons d’échantillonneur automatique à insertion verrouillée Cl SS de 11 mm	Thermo Scientific	Référence 30211SS-1232
Centrifugeuse 5427R	Eppendor
Acétonitrile, grade HPLC	Fisher Chemical	A998-1 1L
Colonne de chromatographie échangeuse de cations (CEX)	GE Healthcare Sciences de la vie	29018183	HiPrep SP Sepharose Haute Performance
Spectromètre de masse EMR Exactive Plus	Thermo Scientific
Flacons Gilson 7x14 mm Tubes	GE Soins de santé	BR-1002-12
Centrifugeuse à grande vitesse/de paillasse	Thermo Fischer Scientific	Référence 05-112-114D	Capable de jusqu’à 4 000 xg
Protéase du virus de gravure du tabac (TEV) His6-Tobacco Etch	Addgene	Référence 92414	Purifié selon Raran-Kurussi et al. (2017) Élimination des marqueurs d’affinité avec la protéase TEV. Dans : Burgess Brown N. (eds) Expression génique hétérologue chez E. coli. Méthodes en biologie moléculaire, vol 1586. Humana Press, New York, État de New York
Cocktail d’inhibiteurs de protéase sans EDTA ou autres chélateurs	Millipore Sigma	Réf. P8849
Acétate d’ammonium	Sigma-Aldrich	09689-250g
Gaz argon	Gaz à air	L’ARUP
acide méthanoïque	Sigma-Aldrich	F0507-500MI	Utilisez un réactif de qualité supérieure ou supérieure
Système de chromatographie NGC	BioRad	78880002	Système de chromatographie NGC QuestTM 100
Kit d’extrudeur de lipides avec support	LIPIDES POLAIRES AVANTI	610023
azote liquide	Gaz à air	NI-DEWAR
Unités de filtration centrifuge Ultra-15, 10K NMWL	Millipore Sigma	UFC901008	Membrane PES
Ultracel 10K MWCO Ultra 0,5 mL Filtres à centrifuger	Amicon	UFC501024
Ultracentrifuge	Beckman Coulter	Optima - L80K	Capable de 100 000 xg
Gars	sigma	Réf. C3023