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1. Préparation des tampons
- Pour préparer le tampon de lavage ELISA, ajoutez 3,94 g de Tris-base, 8,77 g de NaCl et 1 g d’albumine sérique bovine (BSA) à 1 L d’eau désionisée (DI). Ajouter 500 μL de polysorbate-20. Ajustez le pH à 7,2 à l’aide de HCl ou de NaOH.
- Pour préparer le tampon de blocage, ajoutez 3,94 g de Tris-base, 8,77 g de NaCl et 10 g de BSA. Ajouter 500 μL de polysorbate-20 à 1 L d’eau DI. Ajustez le pH à 7,2 à l’aide de HCl ou de NaOH.
- Pour préparer le tampon d’élution (PBS), ajoutez 8,01 g de NaCl, 2,7 g de KCl, 1,42 g de Na2HPO4 et 0,24 g de KH2PO4 à 1 L d’eau DI. Ajustez le pH à 7,4 à l’aide de HCl ou de NaOH.
note: Une solution 10x de ce tampon peut être préparée et diluée avec de l’eau DI si nécessaire.
2. Préparation de l’échantillon OMV
- Cultiver les cellules d’A. actinomycetemcomitans jusqu’à la phase exponentielle tardive (densité optique à 600 nm de 0,7). Granulez les cellules en les centrifugant deux fois à 10 000 x g à 4 °C pendant 10 min. Filtrez le surnageant à travers un filtre de 0,45 μm.
- Concentrez le surnageant exempt de bactéries à l’aide de filtres de coupure de 50 kDa de poids moléculaire. Ultracentrifugeuse la solution concentrée à 105 000 x g à 4 °C pendant 30 min.
- Remettre la pastille en suspension dans du PBS et l’ultracentrifugeuse (105 000 x g à 4 °C pendant 30 min) Remettre la pastille en suspension dans 2 mL de PBS.
3. Emballage de la colonne S-1000
- Mélangez le flacon de base de média filtrant en gel avec un agitateur en verre et versez dans une bouteille en verre le volume nécessaire pour remplir la colonne, plus environ 50 % de l’excédent (environ 135 ml). Laissez ces perles reposer jusqu’à ce qu’elles se déposent, puis décantez l’excès de liquide. Remettez les billes en suspension dans le tampon d’élution, de sorte que la solution finale soit d’environ 70 % (en volume) de gel, 30 % de tampon. Dégazez la solution sous vide.
- Montez la colonne en verre verticalement à l’aide d’un support annulaire et remplissez-la d’un tampon d’élution pour mouiller les parois de la colonne. Videz le tampon jusqu’à ce qu’il ne reste plus qu’environ 1 cm de tampon dans la colonne.
- Sans créer de bulles, pipetez soigneusement les perles dans la colonne, en remplissant la colonne jusqu’en haut. Continuez à vider l’excès de tampon tout au long de ce processus. Assurez-vous de ne pas laisser les perles se déposer complètement avant d’ajouter des perles supplémentaires en haut de la colonne. La colonne doit être emballée à une hauteur d’environ 2 cm sous le fond du réservoir de la colonne.
4. Chargement de l’échantillon et collecte des fractions
- Dégazer le tampon d’élution sous vide. Laver la colonne avec deux volumes de colonne (180 ml) de tampon d’élution.
- Laissez la mémoire tampon restante entrer entièrement dans la colonne. Une fois que le tampon a atteint le sommet de la couche de gel, pipetez soigneusement un échantillon de 2 mL contenant des OMV (à une concentration lipidique d’environ 100 à 200 nmol/L) sur la surface des billes, en prenant soin de ne pas déranger les billes en haut de la colonne. Laissez l’échantillon pénétrer complètement dans le gel, c’est-à-dire lorsqu’il ne reste plus de liquide au-dessus de la couche de gel.
- Ajoutez soigneusement et lentement un tampon d’élution sur le dessus de la colonne de gel. Ne dérangez pas la couche supérieure du gel, car cela provoquerait une dilution de l’échantillon.
- Placez un seul tube de 50 ml sous la colonne et ouvrez la colonne. Prélever les premiers 20 mL de l’éluant. Ajoutez un tampon d’élution supplémentaire sur le dessus de la colonne, avec précaution, si nécessaire pour vous assurer que la colonne n’est jamais sèche.
- Placez une série de tubes de 1,5 mL sous la colonne. Démarrez la colonne et prélevez une série d’échantillons de 1 mL dans chaque tube. Au fur et à mesure que les échantillons sont prélevés, continuez à ajouter du tampon d’élution au sommet de la colonne, si nécessaire. Répétez jusqu’à ce que 96 fractions aient été recueillies. Arrêtez le column.
note: Les échantillons doivent être conservés à -20 °C pour un stockage à long terme ou à 4 °C pour un stockage à court terme jusqu’à une analyse plus approfondie.
- Pour nettoyer la colonne, faites passer un volume de colonne (90 ml) de NaOH 0,1 M à travers la colonne. Faites passer deux volumes de colonne (180 ml) de tampon d’élution à travers la colonne.