1. Produire et caractériser l’anticorps
- Exprimer l’anticorps
- Décongeler un flacon de cellules de suspension HEK dans une fiole de 250 mL contenant 50 mL de milieu d’expression complété par 100 unités/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine et 250 ng/mL d’amphotéricine B. Maintenir les cellules à 37 °C avec 8 % de CO2 dans des incubateurs humidifiés équipés d’un agitateur à 125 tr/min. Divisez les cellules en 0,3-0,5 x 106 cellules/mL (tous les 2-3 jours) au moins 2 fois avant la transfection.
- Lorsqu’une densité de 2,5 x 106 cellules/mL est atteinte (2-3 jours après la séparation), préparez une solution fraîche de 100 mM de CypK. Pour cela, peser 64 mg de CypK, ajouter 2,5 mL d’hydroxyde de sodium 0,1, vortex, tourner vers le bas pour récupérer toutes les particules non dissoutes et soniquer.
- Ajouter 2,5 mL de CypK (100 mM dans 0,1 M de NaOH) à 42,5 mL de milieu d’expression complété par des antibiotiques. Bien mélanger, ajouter 250 μL de HCl 0,1 M et stériliser à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
- Diluer 50 μg de plasmides HC et LC pKym1 à 2,5 mL avec un milieu sérique réduit. Dans un tube séparé, diluer 135 μL de réactif de transfection à 2,5 mL avec un milieu sérique réduit.
- Cinq minutes après la préparation des solutions, mélangez les plasmides et la solution de réactif de transfection et incubez pendant 20 min pour permettre la formation de complexes entre l’ADN et le réactif de transfection.
- Pendant ce temps, centrifuger 125 millions de cellules à la densité cible pendant 5 min à 500 x g, remettre en suspension avec le milieu d’expression contenant CypK et ajouter le mélange de réactifs ADN-transfection. CypK peut être acheté ou synthétisé comme indiqué précédemment.
- Après avoir incubé les cellules pendant 20 h, ajoutez 250 μL d’activateurs de réactifs de transfection inclus dans le kit.
- Récoltez les anticorps du surnageant 6 à 7 jours après l’ajout de CypK (aucun changement de milieu n’est nécessaire pendant l’expression).
*Alternativement, pour obtenir des rendements plus élevés et plus constants, une lignée cellulaire stable peut être générée comme décrit dans Oller-Salvia et al. 2018. Dans ce cas, le trastuzumab(CypK)2 est exprimé simplement par l’ajout de CypK 5 mM dans le milieu d’expression.
- Purifier l’anticorps
- Centrifuger les cellules pendant 15 min à 3000 x g.
- Filtrez le surnageant avec un filtre de 0,45 ou 0,22 μm. Si le filtre est obstrué, remplacez-le par un nouveau et continuez à filtrer. Si cela se produit après seulement quelques millilitres, centrifugez le surnageant pendant 15 minutes supplémentaires à 7000 x g.
- Ajouter de la résine de protéine A (2 mL/100 mL de surnageant) dans une colonne de chromatographie en polypropylène vide et équilibrer la résine avec au moins 5 volumes de tampon de lavage de billes (0,1 M de phosphate de sodium, 150 mM de NaCl).
- Divisez le surnageant en deux tubes coniques de 50 mL et ajoutez 5 tampons de lavage de billes (0,5 M de phosphate de sodium, 150 mM de NaCl) suivis de la résine de protéine A pré-équilibrée. Placez le tube conique sur un rouleau pendant 3 h à température ambiante pour tirer l’anticorps dans le surnageant.
- Alternativement : Ajouter le surnageant sur la colonne avec au moins le double du volume de résine recommandé et laisser couler à travers. Assurez-vous qu’il ne reste pas une quantité importante d’anticorps dans le surnageant par SDS-PAGE. S’il y en a, éluez à nouveau le surnageant à travers la résine.
- Transférez la résine de protéine A avec le surnageant dans une colonne et laissez le liquide s’écouler à travers.
- Ajouter 25 mL de tampon de lavage (ou au moins 10 volumes de résine) et laisser couler.
- Éluer l’anticorps avec 4 mL de citrate de sodium 0,1 M, pH 3, sur 1 mL de tampon phosphate 1 M, 150 mM de NaCl.
- Diluez l’anticorps avec 10 mL de PBS, concentrez-le à 0,5-1 mL par filtration centrifuge et échangez le tampon trois fois avec du PBS.
- Purifier les échantillons par FPLC à l’aide d’une colonne de butyle HIC avec un débit de 0,5 mL/min et un gradient de 0 à 100 % en 30 min de tampon à faible teneur en sel (50 mM de phosphate de sodium pH 7,0, 20 % d’isopropanol) dans un tampon à haute teneur en sel (1,5 M (NH4)2SO4, 50 mM de phosphate de sodium pH 7,0, 5 % d’isopropanol). Collectez toutes les fractions et surveillez l’élution à 280 nm. De petites quantités (< 1 mg) peuvent être purifiées avec la HPLC-HIC dans les conditions décrites en 2.4 pour maximiser le rendement et la pureté.
- Regroupez les fractions contenant des anticorps, diluez-les à au moins 4 mL avec du PBS, concentrez-les par filtration centrifuge et échangez le tampon trois fois avec du PBS.
- Quantifier l’anticorps
- Obtenir une concentration approximative en mesurant l’absorbance à 280 nm à l’aide d’un spectrophotomètre de microvolume.
- Si une mesure précise est requise, utilisez un kit ELISA pour mesurer les IgG humaines. Pour une estimation approximative, utilisez SDS-PAGE avec une coloration à base de Coomassie comme suit :
- Préparer les étalons en diluant six fois deux fois un étalon de trastuzumab quantifié par ELISA à 1 mg/mL.
- Faire bouillir les étalons et les échantillons à environ 0,25 mg/mL dans un tampon de charge réduit.
- Passez-les dans un Bis-Tris SDS-PAGE à 4-12 % à l’aide d’un tampon MES-SDS et colorez-les avec un colorant à base de Coomassie. Enfin, mesurez la densité de couleur de la bande correspondant à la chaîne légère ou lourde à l’aide d’ImageJ et interpolez le signal des échantillons dans la courbe standard.
- Stockez l’anticorps à 4 °C.
2. Conjuguer l’anticorps et caractériser l’ADC
- Conjuguer l’anticorps avec la molécule porteuse de tétrazine
- Diluer 10 équivalents molaires de tétrazine-vcMMAE (4 μL, 3,4 mM dans du sulfoxyde de diméthyle (DMSO)) avec 20 μL d’acétonitrile et 76 μL de PBS dans un petit tube conique (p. ex., tube PCR).
- Ajouter 1 équivalent molaire de trastuzumab(CypK)2 (100 μL, 2 mg/mL dans du PBS), bien mélanger et laisser agir pendant 3 h à température ambiante (25 °C) pour former du trastuzumab(MMAE)2.
note: D’autres molécules telles que la tétrazine-5-TAMRA peuvent être liées à l’anticorps au lieu de la tétrazine-vcMMAE en utilisant ce protocole.
- Purifier l’ADC
- Pré-équilibrez une colonne d'exclusion de taille avec PBS en suivant les instructions du fabricant.
- Ajouter tout le volume de la réaction sur la colonne de centrifugation et centrifuger à 1500 x g pendant 1 min.
- Quantifier l’ADC et analyser le conjugué par SDS-PAGE
- Quantifier l’ADC comme décrit au point 1.3.2 en mesurant la densité de couleur de la chaîne légère sur une FDS-PAGE à l’aide de l’anticorps non modifié pour la courbe standard.
- La chaîne lourde devrait s’être légèrement déplacée, montrant une augmentation de la masse moléculaire lors de la conjugaison.
Remarque : Si l’anticorps est modifié avec un fluorophore tel que dans le trastuzumab (TAMRA)2, seule la bande correspondant à la chaîne lourde doit présenter une fluorescence dans le gel avant la coloration.
- Analyser le conjugué par HPLC-HIC
- Équilibrez la colonne HPLC-HIC avec 100 % de tampon A (1,5 M (NH4)2, SO4, 50 mM, phosphate de sodium, pH 7,0, 5 % d’isopropanol) pendant 5 min.
- Mélanger 15 μL (67 pmol) d’une solution de 1 mg/mL de trastuzumab(CypK)2 avec 15 μL de 2x tampon A dans un flacon. Programmez ensuite une injection de 10 μL dans la HPLC.
- Éluer dans un flux isocratique de 1 mL/min avec 100 % du tampon A pendant 1 min, suivi d’un gradient de 15 min de 100 à 0 % du tampon A dans B (50 mM de phosphate de sodium, pH 7,0, 20 % d’isopropanol). Surveiller l’élution à 280 nm.
- Calculez le DAR en intégrant le pic correspondant à chaque espèce et en utilisant les zones résultantes dans l’équation suivante :
DAR = (1x trastuzumab(MMAE) + 2x trastuzumab(MMAE)2)
/(trastuzumab(MMAE)0 + trastuzumab(MMAE)1 + trastuzumab(MMAE)2)
Le temps de rétention prévu pour le trastuzumab(CypK)2 est de 7,5 à 8,0 min, pour le trastuzumab (CypK, MMAE) de 9,1 à 9,6 min et pour le trastuzumab(MMAE)2 de 10,5 à 11,0 min.