Chromatographie d’exclusion stérique à détection de fluorescence : une technique pour identifier l’intégrité des protéines de membrane fluorescente lors de la solubilisation au détergent

Résumé

Source : Bird, L. E., et al. Green Fluorescent Protein Based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)

Dans cette vidéo, nous démontrons une technique de chromatographie d’exclusion stérique à détection de fluorescence pour dépister la stabilité des protéines membranaires fusionnées à la protéine fluorescente verte (GFP) chez Escherichia coli après solubilisation au détergent. Les protéines présentant un pic symétrique dans le profil d’exclusion stérique avec peu ou pas de GFP libre indiquent des protéines purifiées avec une dégradation et une agrégation minimales, qui peuvent ensuite être sélectionnées pour l’analyse structure-fonction.

Protocole

1.Solubilisation et analyse de la fraction membranaire

1. Décongeler la fraction membranaire (si nécessaire) et, pour chaque détergent à utiliser pour la solubilisation, aliquote 900 μl de la suspension membranaire dans un tube à micro-centrifuger polyallomère de 1,5 ml.
2. Ajouter 100 μl de chaque détergent fraîchement préparé (solutions à 10 % p/v de DDM, DM, Cymal-6 et LDAO) à une concentration finale de 1 % dans le tube de 1,5 ml spécifié. Pour la solubilisation des protéines membranaires eucaryotes, de l’hemisuccinate de cholestérol (concentration finale de 0,2 %) peut être ajouté aux détergents.
3. Incuber les mélanges à 4 °C pendant 1 heu....

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cholestérol hémisuccinate	Sigma-Aldrich	Réf. C6512
CYMAL-6 (6-cyclohexyl-1-hexyl-βD-maltoside)	Anatrace	Réf. C326
DDM (n-Dodécyle β-maltoside)	Generon	D97002
DM (n-Décyl β-maltoside)	Generon	Réf. D99003
LDAO (N,N-Diméthyl-ndodécylamine N-oxyde)	Generon	D71111
Étalon de protéine fluorescente BenchMark	Technologies de la vie	LC5928
Optima L-100 Ultracentrifugeuse fonctionnant avec rotor 45-Ti	Beckman Coulter	393253
Ultracentrifugeuse Optima Max-XP fonctionnant avec rotor TLA-55	Beckman Coulter	393315
Prominence UFLC avec détecteur de fluorescence RF-20A	Shimadzu
Colonne d’exclusion de taille Sepharose 6 10/300 GL	GE Soins de santé	Référence : 17-5172-01