Chromatographie d’exclusion stérique à détection de fluorescence : une technique pour identifier l’intégrité des protéines de membrane fluorescente lors de la solubilisation au détergent

Résumé

Source : Bird, L. E., et al. Green Fluorescent Protein Based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (2015)

Dans cette vidéo, nous démontrons une technique de chromatographie d’exclusion stérique à détection de fluorescence pour dépister la stabilité des protéines membranaires fusionnées à la protéine fluorescente verte (GFP) chez Escherichia coli après solubilisation au détergent. Les protéines présentant un pic symétrique dans le profil d’exclusion stérique avec peu ou pas de GFP libre indiquent des protéines purifiées avec une dégradation et une agrégation minimales, qui peuvent ensuite être sélectionnées pour l’analyse structure-fonction.

Protocole

1.Solubilisation et analyse de la fraction membranaire

1. Décongeler la fraction membranaire (si nécessaire) et, pour chaque détergent à utiliser pour la solubilisation, aliquote 900 μl de la suspension membranaire dans un tube à micro-centrifuger polyallomère de 1,5 ml.
2. Ajouter 100 μl de chaque détergent fraîchement préparé (solutions à 10 % p/v de DDM, DM, Cymal-6 et LDAO) à une concentration finale de 1 % dans le tube de 1,5 ml spécifié. Pour la solubilisation des protéines membranaires eucaryotes, de l’hemisuccinate de cholestérol (concentration finale de 0,2 %) peut être ajouté aux détergents.
3. Incuber les mélanges à 4 °C pendant 1 heure en agitant doucement.
4. Granulez la fraction insoluble dans le détergent à l’aide d’une ultracentrifugeuse de paillasse, en veillant à ce que les tubes soient au moins à moitié pleins, à 150 000 g à 4 °C pendant 45 minutes et en conservant le surnageant.
   note: L’efficacité de la solubilisation au détergent peut être estimée à l’aide d’un lecteur de plaques fluorescentes en mesurant la fluorescence GFP des membranes solubilisées avec la fraction insoluble dans le détergent remise en suspension dans le même volume de PBS.
5. Analysez la mono-dispersité des différents complexes détergents/protéines membranaires à l’aide de la chromatographie d’exclusion stérique (FSEC) détectée par fluorescence.
6. Pour l’analyse FSEC, équilibrez une colonne d’exclusion granulométrique avec une large plage de fractionnement, par exemple de 5 000 à 5 000 000 de poids moléculaire, avec un tampon de fonctionnement (20 mM Tris pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,03 % DDM) à un débit de 0,3 ml/min. Utilisez ce tampon pour tous les échantillons, c’est-à-dire qu’il n’est pas modifié pour chaque détergent testé.
7. Injecter 100 μl de membranes solubilisées sur la colonne à un débit de 0,3 ml/min. Surveiller le profil d’élution à l’aide d’optiques de fluorescence (excitation à 488 nm et émission à 512 nm). Si aucun moniteur de fluorescence en ligne n’est disponible, collectez les fractions et lisez la fluorescence dans un lecteur de plaques.
8. Importez les données de volume d’élution et d’intensité de fluorescence dans un tableur pour affichage graphique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cholestérol hémisuccinate	Sigma-Aldrich	Réf. C6512
CYMAL-6 (6-cyclohexyl-1-hexyl-βD-maltoside)	Anatrace	Réf. C326
DDM (n-Dodécyle β-maltoside)	Generon	D97002
DM (n-Décyl β-maltoside)	Generon	Réf. D99003
LDAO (N,N-Diméthyl-ndodécylamine N-oxyde)	Generon	D71111
Étalon de protéine fluorescente BenchMark	Technologies de la vie	LC5928
Optima L-100 Ultracentrifugeuse fonctionnant avec rotor 45-Ti	Beckman Coulter	393253
Ultracentrifugeuse Optima Max-XP fonctionnant avec rotor TLA-55	Beckman Coulter	393315
Prominence UFLC avec détecteur de fluorescence RF-20A	Shimadzu
Colonne d’exclusion de taille Sepharose 6 10/300 GL	GE Soins de santé	Référence : 17-5172-01