Chromatographie d’affinité basée sur DFE : une technique de purification d’anticorps monoclonaux 2F5 à partir d’un échantillon brut à l’aide de conditions d’élution basées sur une force ionique élevée

Abstract

Source : Knödler, M. et al., Agarose réticulée activée pour le développement rapide de résines de chromatographie d’affinité - Capture d’anticorps comme étude de cas. J. Vis. Exp. (2019).

Cette vidéo décrit une technique de chromatographie d’affinité pour purifier les anticorps monoclonaux 2F5 à l’aide des ligands DsRed-2F5-Epitope ou DFE. Les anticorps monoclonaux 2F5 purifiés sont des médicaments essentiels en immunothérapie.

Protocol

1. Test de la purification des anticorps monoclonaux à partir d’extraits de plantes clarifiées

1. Préparez 100 mL d’extrait de plante clarifié contenant du 2F55 ou le surnageant du système d’expression cellulaire préféré, contenant également du 2F5.
2. Préparez un tampon d’équilibrage (20 mM de phosphate de sodium, 500 mM de chlorure de sodium, pH 7,4), un tampon d’élution à faible pH (0,05 M de citrate, 0,05 M de chlorure de sodium, pH 4,0-3,25) et un tampon d’élution à haute force ionique (1,0-4,0 M de chlorure de magnésium, 0,1 M HEPES, pH 8,0)
3. Rincez le système de chromatographie avec les tampons. Monter une colonne d’affinité DFE (Se référer au texte principal du protocole) sur le système de chromatographie et équilibrer avec 5 CV de tampon d’équilibrage à un débit de 1,0 mL ^min-1. Surveiller l’absorbance UV à 280 nm.
   note: Le chargement d’un extrait de plante ou d’un surnageant de culture cellulaire sur la colonne peut entraîner une augmentation de la contre-pression. Réglez une alerte de haute pression à 0,2 MPa pour éviter d’endommager le système de chromatographie ou la colonne DFE.
4. Chargez 80 mL d’extrait végétal clarifié ou de surnageant (étape 1.1) sur la colonne à un débit de 0,5 mL min-1 pour garantir un temps de contact de 2 min. Prélevez les échantillons à flux continu en fractions de 2 mL pour la reconstruction de la courbe de percée. Stocker les échantillons à 4 °C si l’analyse immédiate des échantillons n’est pas possible.
5. Laver la colonne avec 6 CV de tampon d’équilibrage. Prélevez un échantillon du lavage au début, au milieu et à la fin de cette étape.
6. Éluer mAb 2F5 avec 5 CV de tampon d’élution à faible pH ou à haute force ionique (0,1 M HEPES, 1,25 M de chlorure de magnésium, pH 8,0). Collectez la fraction DFE lorsque le signal UV 280 nm a augmenté à 5 mAU au-dessus de la ligne de base.
   1. Optimisez le tampon d’élution pour chaque paire épitope-anticorps. Pour 2F5, le chlorure de magnésium 1,25 M a atteint un équilibre optimal entre la récupération du produit et la stabilité des ligands.
      note: La solution de chlorure de magnésium est sujette aux précipitations. Par conséquent, dissoudre le chlorure de magnésium dans ~700 mL d’eau. Dissoudre séparément le HEPES dans 100 mL d’eau et ajuster le pH à 8,0. Ajouter la solution de chlorure de magnésium dissoute à la solution d’HEPES et ajouter de l’eau jusqu’à un volume final de 1,0 L. N’ajustez pas le pH après avoir dissous le chlorure de magnésium car cela provoquerait des précipitations.
7. Analysez tous les échantillons prélevés au cours des étapes 1.4 à 1.6 à l’aide de la méthode Bradford, de l’électrophorèse sur gel de dodécylsulfate-polyacrylamide de lithium (LDSPAGE) et de la spectroscopie par résonance plasmonique de surface (SPR).

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DsRed	Fraunhofe IME	n/a	Norme
HiTrap Sepharose HP, activé par le NHS, 1 mL	GE Helthcare	Référence 17-0716-01	Colonnes de chromatographie
HEPES	Carl Roth GmbH	Référence 9105.3	Composant tampon
chlorure de magnésium	Carl Roth GmbH	KK36.2	Composant tampon
Réf. 3110	WTW	2AA110	Ph-mètre
Sephadex G-25 fin, dextran réticulé	GE Helthcare	17003301	Résine de chromatographie
chlorure de sodium	Carl Roth GmbH	Réf. P029.2	Composant tampon
Citrate de sodium	Carl Roth GmbH	HN13.2	Composant tampon