Dosage de l’activité enzymatique basé sur la chromatographie sur couche mince : une technique pour déterminer l’activité de la pyrophosphokinase in vitro à l’aide de la chromatographie sur couche mince

Résumé

Source : Pokhrel, A., et al. A Purification et Activité In Vitro pour une (p)ppGpp Synthetase de Clostridium difficile. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo présente un dosage enzymatique basé sur la chromatographie sur couche mince pour déterminer l’activité de la pyrophosphokinase à l’aide de nucléotides radiomarqués. La méthode fournit des informations sur la synthèse des nucléotides et les réactions de phosphotransfert.

Protocole

1. Dosage de l’activité protéique par chromatographie sur couche mince

1. Préparez la plaque de chromatographie sur couche mince (CCM).
   1. Préparez les plaques de polyéthylèneimine (PEI)-cellulose en les lavant à l’eau désionisée. Placez les plaques dans une chambre en verre avec de l’eau distillée deux fois à une profondeur de ~0,5 cm.
   2. Laisser l’eau migrer vers le haut de la plaque.
      REMARQUE : Le lavage des plaques n’est pas strictement nécessaire, car les plaques peuvent être utilisées sans lui, mais le lavage augmente la clarté des images résultantes. Le lavage des plaques dans deux directions perpendiculaires permet de s’assurer que tous les contaminants présents dans la résine sont isolés dans un coin de la plaque (Figure 1).
   3. Sortez les plaques de la chambre en verre et laissez-les sécher sur une grille de paillasse pendant la nuit (12 à 18 h).
   4. Marquez les plaques sèches à 2,0 cm d’un bord avec un crayon doux pour indiquer où les échantillons seront appliqués pour la CCM. Pour des échantillons de 2 μL, appliquer les échantillons à au moins 1,0 cm de distance (figure 1).
      REMARQUE : Cela permet une séparation claire entre les points adjacents, ce qui est essentiel pour la quantification du signal. Tant que la résine cellulosique n’est pas rayée, de petites marques de crayon sur la surface n’interféreront pas avec la migration des solvants.
   5. Lorsque vous planifiez des expériences, laissez toujours un endroit inutilisé sur chaque plaque.
      REMARQUE : Cela fournira une voie vide pour la quantification de l’échantillon (Figure 1). Une plaque TLC de 20 cm aura de la place pour 19 spots.
2. Dosage de l’activité enzymatique
   1. Préparez un mélange tampon 5x contenant 50 mM de Tris-HCl (pH 7,5), 25 mM d’acétate d’ammonium, 10 mM de KCl, 1 mM de DTT et 0,6 mM d’ATP (adénosine triphosphate).
      REMARQUE : Ce mélange peut être préparé en grande quantité et congelé dans des aliquotes de 10 μL pour une utilisation ultérieure. Ne soumettez pas le mélange à plusieurs cycles de gel-dégel.
   2. Préparez des réactions individuelles contenant 3 μM RSH (enzymes homologues Rel/Spo), 1x mélange tampon, 0,6 mM de GDP (guanosine diphosphate), 1,2 mM de MgCl₂. Ajouter 1,0 μCi de ^γ-32P-ATP (ATP radiomarqué) par 10 μL de réaction et utiliser de l’eau sans nucléases pour amener la réaction au volume souhaité. Ajouter le RSH après que les autres composants ont été mélangés, car l’ajout de RSH au mélange contenant des nucléotides déclenche le test d’activité enzymatique.
      REMARQUE : Le volume final de la réaction dépendra du nombre de points temporels échantillonnés. Pour échantillonner 2 μL/point temporel, assemblez 10 μL de mélange réactionnel pour chaque 4 points temporels.
   3. Pour empêcher l’hydrolyse de l’ATP de contaminer l’activité des nucléases, assemblez une réaction de 10 μL ne contenant aucune protéine et incubez-la en parallèle. Repérer des échantillons de 2 μL à t = 0 et à la fin de l’expérience pour s’assurer que l’ATP n’a pas été hydrolysé en l’absence de protéine.
   4. Immédiatement après l’ajout de RSH, prélever 2 μL et le repérer sur la plaque de PEI-cellulose étiquetée comme t = 0 min d’échantillon.
   5. Incuber la réaction à 37 °C, en prélevant 2 μL d’aliquotes aux moments souhaités.
      REMARQUE : L’activité enzymatique cessera lorsque l’échantillon sera adsorbé sur la plaque de cellulose. Attendre 10 à 30 minutes après l’ajout du dernier point à la plaque avant le développement pour assurer une adsorption complète et un séchage de l’échantillon.
3. Chromatographie sur couche mince
   1. Remplissez la chambre de chromatographie avec 1,5 M 1,5 M KH₂PO₄ (pH 3,64) jusqu’à une profondeur de 0,5 cm.
      REMARQUE : Le volume nécessaire dépendra des dimensions de la cuve de chromatographie. Tout récipient en verre dont le fond est suffisamment large pour permettre l’insertion de la plaque TLC sans se plier peut être utilisé comme réservoir de développement avec l’ajout d’un couvercle. La plaque TLC peut être coupée en bandes plus étroites avec une lame de rasoir propre pour permettre le développement dans un bécher en verre recouvert d’un film plastique.
   2. Immergez le bord inférieur de la plaque dans le solvant. Laisser le solvant migrer vers le haut de la plaque (~90 min).
      REMARQUE : Bien que la migration du solvant s’arrête en haut de la plaque et que les échantillons ne soient pas perdus ou assemblés lors d’une immersion plus longue, les plaques ne doivent pas être laissées dans le solvant pendant la nuit. Les immersions de plus de 4 h peuvent provoquer le détachement de la résine du support de la plaque et entraîner une perte de signal.
   3. Retirez la plaque de la cuve de chromatographie et placez-la sur un séchoir de paillasse.
   4. Laissez la plaque sécher à l’air libre pendant la nuit.
      REMARQUE : Le séchage peut être accéléré à l’aide d’un sèche-cheveux. La sécheresse peut être évaluée par la couleur de la résine, qui s’assombrit lorsqu’elle est mouillée et reprend la couleur d’une plaque inutilisée lorsqu’elle est complètement sèche.
   5. Une fois la plaque sèche, enveloppez-la dans un film plastique pour éviter le transfert de matières radioactives sur la cassette d’imagerie et analysez-la par autoradiographie (figure 2).
4. Analyse des données
   1. Exposer la plaque PEI-cellulose contenant les réactions séparées à une cassette de phosphorimageur pendant 4 h à température ambiante.
      REMARQUE : Il s’agit d’une exposition suffisante pour donner une image très claire en utilisant les concentrations indiquées de ^γ-32P-ATP frais. Si des quantités plus faibles de substrat radiomarqué sont utilisées, le temps d’exposition peut être porté à 12-16 h.
   2. Imagez la cassette sur un imageur phosphore.
   3. À l’aide d’un logiciel d’imagerie doté d’une interface utilisateur graphique, dessinez des régions d’intérêt (ROI) en sélectionnant Dessiner un rectangle et en utilisant la souris pour dessiner des ROI rectangulaires autour d’une voie entière et des points ATP et ppGpp (Guanosine tétraphosphate) contenus dans cette voie (Figure 2).
   4. Utilisez les commandes Sélectionner, Copier et Coller (ou les commandes correspondantes basées sur le logiciel d’imagerie utilisé) pour dessiner des zones d’intérêt identiques dans les autres voies afin de vous assurer que les zones d’intérêt mesurent le signal dans des zones identiques dans chaque voie. Inclure les retours sur investissement d’une voie inutilisée, à utiliser comme blancs.
   5. À l’aide de l’outil Analyser | Outils | Responsable ROI | Ajoutez les commandes du logiciel d’imagerie, sélectionnez tous les ROI dessinés sur la plaque de cellulose PEI.
   6. À l’aide de l’outil Analyser | Définir les mesures | Mesurez les commandes, quantifiez l’intensité du signal dans chaque retour sur investissement et exportez les mesures sous forme de tableur (Figure 2). Soustrayez les valeurs de retour sur investissement vides des signaux expérimentaux.
      

Résultats

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cuve de développement de chromatographe sur couche mince (CCM)	General Glass Blowing Company	80-3
Plaques en polyéthylénimine (PEI)-cellulose (20 cm x 20 cm, 100 μm d’épaisseur) avec support en polyester	Sigma-Aldrich	Z122882-25EA
ATP, [γ-32P]- 3000 Ci/mmol 10mCi/ml de plomb, 100 μCi	Perkin Elmer	NEG002A
Adénosine 5'-triphosphate (ATP) 100 mM	Bio Basic Canada	AB0311
Sel disodique de guanosine-5'-diphosphate (GDP)	Alfa Aesar	AAJ61646MC/E
Ecran de stockage au phosphore	GE Healthcare Sciences de la vie	Écran au tritium BAS-IP TR 2040 E
Imageur phosphorescent Storm 860	GE Healthcare Sciences de la vie	-