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1. Chromatographie sur couche mince à haute performance (HPTLC) pour semi-quantifier la quantité de plusieurs lipides, dont le cholestérol, les phospholipides et la sphingomyéline
- Préparez les quatre solutions de coulée et de coloration suivantes.
- Solution 1 : Mélangez de l’acétate d’éthyle (26,6 %), du 1-propanol (26,6 %), du chloroforme (26,6 %), du méthanol (26,6 %) et du chlorure de potassium (9,6 %). Préparez le KCl en dissolvant 0,25 g de KCl dans 100 mL d’eau de qualité HPLC.
- Solution 2 : Mélangez du n-hexane (73 %), de l’éther diéthylique (23 %) et de l’acide citrique (2 %).
- Solution 3 : 100 % de n-hexane.
- Préparez la solution de coloration en mélangeant de l’eau distillée (90 ml) avec 7,5 g de sulfate de cuivre, puis ajoutez 10 ml d’acide phosphorique.
- Remplissez jusqu’à 5 mm de chaque solution dans une chambre en verre séparée. Ajoutez n’importe quel type de papier filtre pour augmenter la vitesse de fonctionnement dans chaque chambre.
- Pré-incubez une plaque de verre de gel de silice HPTLC 60 de 20 x 10 cm dans la première solution de coulée jusqu’à ce que la solution de coulée atteigne le haut de la plaque. Ensuite, séchez-le pendant 10 min à 110 °C.
note: Ces plaques peuvent être stockées pour une utilisation future dans du papier d’aluminium et séchées pendant 10 min à 110 °C avant d’être utilisées.
- Dissoudre une pastille lipidique obtenue à partir de neutrophiles dérivés du sang périphérique humain dans 200 μL de solution de chloroforme/méthanol (1:1) et incuber pendant 15 min à 37 °C pour dissoudre.
- À l’aide d’une règle et d’un crayon doux, marquez les points de chargement pour le nombre d’échantillons souhaité, plus au moins un étalon. Marquez la distance de course à environ 4 cm et 6 cm pour la première et la deuxième solution de course, respectivement.
- Pour charger les échantillons, laver la seringue de 10 μL 3 fois dans du chloroforme/méthanol (1:1) avant de charger chaque nouvel échantillon. Chargez 10 μL de chaque échantillon par gouttes, en essayant de concentrer l’échantillon sur une zone aussi petite que possible. Les échantillons doivent être chargés au moins en double.
- Placez la plaque verticalement dans la première chambre avec la solution courante 1 (étape 1.1.1). Assurez-vous que la plaque est parallèle à la paroi de la chambre en verre pour obtenir une vitesse de migration uniforme.
- Une fois que la ligne de solvant a atteint le premier repère, retirez la plaque, séchez-la et placez-la dans la deuxième solution. Répétez les étapes similaires pour la deuxième et pour la troisième solution en cours d’exécution ; laisser la plaque dans la solution jusqu’à ce que la face du solvant atteigne le haut de la plaque, puis la retirer et la sécher à RT pendant 1 min.
- Placez la plaque dans une solution de sulfate de cuivre pendant 7 secondes. Retirez la plaque, séchez-la soigneusement et faites-la cuire au four pendant 7 minutes à 170 °C. Attendez que la plaque refroidisse.
- À l’aide d’un logiciel de chromatographie sur couche mince et d’analyse de gel, ainsi que d’un logiciel de traitement d’image, balayez et analysez pour identifier les bandes de lipides résolues.