Électrophorèse sur gel de polyacrylamide : une technique analytique pour détecter les sulfates d’héparane de différentes longueurs de chaîne isolés dans le tissu pulmonaire de souris

Résumé

Source : LaRiviere, W. B. et al., Détection des glycosaminoglycanes par électrophorèse sur gel de polyacrylamide et coloration à l’argent. J. Vis. Exp. (2021)

Cette vidéo montre la procédure de séparation des sulfates d’héparane isolés du tissu pulmonaire de souris à l’aide de l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide.

Protocole

1. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide de glycosaminoglycanes isolés et purifiés

1. Préparez à l’avance les solutions nécessaires à l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide (PAGE) (Tableau 1).
   note: Sélectionnez le pourcentage d’acrylamide de la solution de gel en résolution en fonction de la taille des glycosaminoglycanes attendus dans l’échantillon. 15 % sont recommandés pour la résolution de fragments plus gros (plus de 30 sous-unités disaccharides de longueur) ; 22 % pour les fragments plus petits (<20 sous-unités disaccharides de longueur).
2. Placez la cassette vide dans le réservoir PAGE. Dans un tube de 15 ml, mélanger 10 ml de solution de gel de résolution, 60 μL de persulfate d’ammonium à 10 % (doit être fraîchement préparé) et 10 μL de TEMED (ajouter TEMED en dernier). Retournez doucement le tube 2-3x. À l’aide d’une pipette, ajoutez rapidement la solution de 10 ml ci-dessus dans la cassette. Recouvrez avec 2 mL d’eau déminéralisée et filtrée et laissez le gel de résolution polymériser pendant 30 min.
   note: Le protocole PAGE suivant a été optimisé pour un système PAGE vertical utilisant des cassettes de coulée de 13,3 x 8,7 cm (largeur x longueur) de 1,0 mm d’épaisseur avec un volume total d’environ 12 ml. D’autres systèmes de cassettes peuvent être utilisés, mais peuvent nécessiter une optimisation de la part de l’utilisateur final.
3. Une fois que le gel de résolution a complètement polymérisé, jeter l’eau recouverte et couler le gel d’empilage comme suit : dans un tube de 15 mL, mélanger 3 mL de solution de gel d’empilage, 90 μL de persulfate d’ammonium à 10 % (doit être fraîchement préparé), 3 μL de TEMED (ajouter TEMED en dernier).
4. Retournez doucement le tube 2-3x. À l’aide d’une pipette, ajoutez rapidement la solution de gel d’empilement sur le gel de résolution solidifié ; Remplissez la cassette à ras bord. Insérez complètement le peigne inclus avec l’installation. Laisser le gel d’empilage polymériser pendant 30 min.
5. Une fois le gel polymérisé, assurez-vous que la bande de ruban est retirée du bas de la cassette et replacez la cassette dans l’ensemble de réservoir PAGE.
6. Remplissez les chambres supérieure et inférieure avec un tampon dans les chambres supérieure et inférieure, respectivement.
7. Dissoudre les échantillons séchés de l’étape 1.11.4 dans le volume minimum nécessaire d’eau déminéralisée et filtrée (au maximum, 50 % du volume des puits dans le gel PAGE). Mélanger 1:1 avec tampon de chargement d’échantillon. Chargez les échantillons et les « échelles » d’oligosaccharides HS (voir tableau 1) dans le gel.
8. Pré-faites fonctionner le gel pendant 5 min à 100 V. Ensuite, faites fonctionner le gel à 200 V pendant 20-25 min (pour un gel résolutif de polyacrylamide à 15 %), 40-50 min (pour un gel de résolution de polyacrylamide à 18 %), 90-100 min (pour un gel de résolution de polyacrylamide à 22 %).
   note: Une certaine optimisation de la durée de fonctionnement de 200 V peut être nécessaire. Le rouge de phénol migre avant les oligosaccharides d’héparine qui ont une longueur de 2 sous-unités de polymère (c’est-à-dire un degré de polymérisation de 2, ou dp2) ; Le bleu de bromophénol migre avant DP10-DP14. Les meilleurs résultats sont obtenus lorsque la tension est appliquée de telle sorte que la bande rouge de phénol migre presque, mais pas tout à fait, vers le fond du gel. Ajustez le temps d’exécution en conséquence.

Résultats

Tableau 1 : Solutions nécessaires pour l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide de glycosaminoglycanes purifiés. Toutes les solutions doivent être filtrées (0,22 μm) avant utilisation.

REMARQUE : Toutes les solutions doivent être filtrées (0,22μm) avant utilisation.
solution	recette

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Persulfate d’ammonium (solide)	ThermoFisher Scientific	BP179-25	Grade d’électrophorèse
Système de purification d’eau Barnstead GenPure Pro	ThermoFisher Scientific	10-451-217PAQUET	Tout système de déionisation / purification de l’eau est un substitut acceptable
Acide borique (solide)	ThermoFisher Scientific	Réf. A73-500	Grade de biologie moléculaire
Bleu de bromphénol (solide)	ThermoFisher Scientific	Réf. B392-5
Cassette vide Criterion pour PAGE (1,0 mm d’épaisseur, 12+2 puits)	Bio-Rad	3459901	N’importe quel système de cassette de coulée PAGE de 1,0 mm d’épaisseur suffira
Critère PAGE Système de cellules (cellule et alimentation)	Bio-Rad	1656019	N’importe quel système PAGE vertical comparable fonctionnera)
Sel disodique EDTA (solide)	ThermoFisher Scientific	Référence : 02-002-786	Grade de biologie moléculaire
Glycine (solide)	ThermoFisher Scientific	G48-500	Grade d’électrophorèse
Acide chlorhydrique (liquide)	ThermoFisher Scientific	Réf. A466-250
N,N'-méthylène-bis-acrylamide (solide)	ThermoFisher Scientific	Réf. BP171-25	Grade d’électrophorèse
Rouge de phénol (solide)	ThermoFisher Scientific	Réf. P74-10	Acide libre
Saccharose (solide)	ThermoFisher Scientific	BP220-1	Grade de biologie moléculaire
TEMED (N,N,N',N'-tétraméthylènediamine)	ThermoFisher Scientific	BP150-20	Grade d’électrophorèse
Base Tris (solide)	ThermoFisher Scientific	BP152-500	Grade de biologie moléculaire
Unité de filtration sous vide, à usage unique, 0,22 uM pore PES, volume de 500 ml	ThermoFisher Scientific	Référence 569-0020	D’autres volumes et matériaux filtrants sont acceptables
Acrylamide (solide)	ThermoFisher Scientific	BP170-100	Grade d’électrophorèse
Décasaccharide dérivé de l’héparine (dp10)	Galien, scientifique	HO10
Hexasaccharde dérivé de l’héparine (dp6)	Galien, scientifique	HO06
Oligosaccharide dérivé de l’héparine (dp20)	Galien, scientifique	HO20