Électrophorèse sur gel de polyacrylamide de dodécylsulfate de sodium pour l’analyse des protéines : une technique pour séparer et visualiser les protéines en fonction de leur poids moléculaire

Résumé

Source : Sultana, S. et al. Extraction et visualisation d’agrégats de protéines après traitement d’Escherichia coli avec un facteur de stress protéotoxique. J. Vis. Exp. (2021).

Cette vidéo présente une technique de séparation dénaturante à base de polyacrylamide pour les protéines. Cette technique permet d’identifier avant tout les protéines en fonction de leur poids moléculaire.

Protocole

1. Séparation et visualisation des agrégats de protéines extraits à l’aide de SDS-PAGE

1. Préparez un gel de polyacrylamide à 12 % de SDS
   1. Pour deux gels de séparation, pipeter 5,1 mL d’eau doublement distillée (ddH₂O), 3,75 mL de Tris-HCl (pH 8,8), 7,5 mL de SDS à 20 % (p/v), 6 mL de solution d’acrylamide/bisacrylamide à 30 % (29:1), 75 mL de persulfate d’ammonium à 10 % p/v et 10 mL de tétraméthyléthylènediamine (TEMED) dans un tube à centrifuger de 15 mL et mélanger doucement sans introduire de bulles d’air. Versez le gel à l’aide d’une pipette de 1 mL à l’intérieur des plaques de verre, en laissant les 2 cm supérieurs libres du mélange. Ajoutez 70 % d’éthanol sur le dessus du gel de séparation et permettez une interface uniforme entre les deux couches.
   2. Après la polymérisation du gel de séparation, préparer le gel d’empilage en pipetant 1,535 mL de ddH₂O, 625 mL de Tris-HCl (pH 6,8), 12,5 mL de SDS à 20 % (p/v), 335 mL de solution d’acrylamide/bisacrylamide à 30 % (29:1), 12,5 mL de persulfate d’ammonium à 10 % p/v et 2,5 mL de TEMED. Retirez l’éthanol des gels de séparation et ajoutez la solution de gel d’empilement. Insérez un peigne avec le nombre de poches souhaité sans introduire de bulles d’air. Laisser polymériser pendant 20-30 min.
2. Chargez 4 μL de chaque échantillon et échelle de protéines dans des puits séparés et faites fonctionner le(s) gel(s) dans le tampon de coulée Tris-Glycine (Tableau 1) à 144 V pendant 45 min à température ambiante.
   note: Arrêtez le gel lorsque la bande de bromophénol est sur le point de migrer hors du gel.
3. Teindre le(s) gel(s) dans une solution Fairbanks A préchauffée (tableau 1) pendant 30 minutes sur une bascule.
4. Décolorer le(s) gel(s) dans une solution Fairbanks D préchauffée (tableau 1) jusqu’à l’arrière-plan désiré (par exemple, toute la nuit) sur un rocker.

Résultats

Solutions	Recettes
Zone tampon A	10 mM de phosphate de potassium (pH 6,5), 1 mM d’EDTA
Tampon B	Zone tampon A contenant 2 % de Nonidet P-40. Peut être conservé à température ambiante pour une utilisation ultérieure.
Fairbanks A (solution de coloration)	25 % d’isoprop...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Produits chimiques/réactifs
acétone	Fisher Scientific	Référence 67-64-1
Solution d’acrylamide/bisacrylamide à 30 % 29:1	Bio-Rad	1610156
Persulfate d’ammonium	Millipore Sigma	A3678-100G
Bluestain 2 Échelle protéique, 5-245 kDa	OrBiographie	Réf. P008-500
β-mercaptoéthanol	Millipore Sigma	M6250-100ML
Bleu de bromophénol	OrBiographie	Réf. B-092-25
Coomassie Bleu Brillant R-250	MP Biomedicals LLC	821616
Acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA)	Sigma-Aldrich	SLBT9686
Acide acétique glacial	Millipore Sigma	ARK2183-1L
Glycérol, 99 %	Sigma-Aldrich	Référence G5516-1L
glycine	OrBiographie	G-630-1
Isopropanol (2-propanol)	sigma	402893-2,5 L
10x tampon MOPS	Teknova	Référence M2101
Dodécylsulfate de sodium (FDS)	Sigma-Aldrich	L3771-500G
Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)	Millipore Sigma	Réf. T9281-50ML
Base Tris	OrBiographie	T-400-1
Matériel/Équipement
alimentation	ThermoFisher Scientific	EC105
rockeur	Alkali Scientific	Réf. RS7235
Petite plaque de verre	Bio-Rad	1653311
Plaques d’espacement (1 mm)	Bio-Rad	1653308
spectrophotomètre	Thermoscientifique	3339053
Centrifugeuse de table pour tubes de centrifugation de 15 mL	Beckman-Coulter
Chambre d’électrophorèse verticale sur gel	Bio-Rad	1658004
Vortex	Fisher Vortex Genie 2	Référence 12-812
Thermomélangeur	Benchmark scientifique	H5000-HC
Peigne à 10 puits	Bio-Rad	1653359