Dénaturation de l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide d’urée pour l’analyse de l’ARN : une technique pour séparer les oligonucléotides d’ARN phosphorylé marqués par fluorescence de leurs équivalents non phosphorylés

Résumé

Source : Pillon, M. C., et al., Essai non radioactif pour mesurer la phosphorylation polynucléotidique de petits substrats nucléotidiques. J. Vis. Exp. (2020)

Dans cette vidéo, nous démontrons une électrophorèse sur gel de polyacrylamide dénaturante pour la séparation des espèces d’ARN phosphorylées de leurs homologues non phosphorylés. Les espèces d’ARN sont marquées par fluorescence pour une détection laser sur le gel.

Protocole

1. Électrophorèse sur gel

1. Préparez une solution de gel d’acrylamide à 15 % et d’urée 8 M.
   prudence: L’acrylamide doit être manipulé avec précaution, car il s’agit d’une neurotoxine. Portez toujours des gants, une blouse de laboratoire et des lunettes de protection lorsque vous le manipulez.
   1. Dans un bécher en verre de 150 ml, mélanger 22,5 ml de solution prémélangée d’acrylamide/bis-acrylamide 29:1 à 40 %, 6 ml de 10x TBE, 28,8 g d’urée et de l’eau sans RNase jusqu’à un volume total de 59 ml. Remuez doucement la solution.
      note: En fonction de la longueur du substrat d’ARN, la modification du pourcentage de polyacrylamide peut améliorer la résolution entre l’ARN non phosphorylé et phosphorylé.
   2. Pour dissoudre l’urée, chauffez la solution au micro-ondes pendant 20 secondes, remuez le liquide et remettez immédiatement la solution dans le micro-ondes pendant encore 20 secondes. Remuez doucement la solution jusqu’à ce que l’urée se dissolve complètement.
   3. Refroidissez lentement la solution en plaçant le bécher en verre dans un bain d’eau peu profond contenant de l’eau froide. Assurez-vous que le niveau d’eau froide entourant le bécher en verre est supérieur au niveau de solution à l’intérieur du bécher en verre. Cela favorisera un transfert de chaleur efficace. Attendre 5 min.
      note: Ne continuez pas avec ce protocole si le bécher en verre est chaud ; l’eau doit être inférieure à 25 °C. S’il fait encore chaud après 5 minutes, remplacez l’eau du bain-marie par de l’eau fraîche et froide et attendez encore 5 minutes.
   4. Filtrez et dégazez la solution à l’aide d’une unité de filtration jetable de 0,22 μm pour éliminer les particules et les bulles d’air microscopiques.
2. Versez le gel dénaturant
   1. Utilisez du savon et de l’eau tiède pour nettoyer une plaque de verre courte et longue conçue pour les gels de dimensions totales de 31,0 cm x 38,5 cm. Vaporisez chaque plaque de verre avec de l’éthanol à 95 % et essuyez le verre pour éliminer toute humidité.
      note: L’une des deux plaques peut être siliconée pour éviter d’endommager le gel lors de la séparation du sandwich de plaque de verre. Cependant, cette étape n’est pas nécessaire car ce protocole est conçu pour visualiser l’ARN sans séparer les plaques de verre.
   2. Placez la longue plaque de verre horizontalement sur le dessus d’une boîte de manière à ce qu’elle soit surélevée par rapport à la paillasse.
      prudence: L’acrylamide est toxique, c’est pourquoi la station de versement de gel doit être recouverte de papier d’établi capable d’absorber tout liquide renversé et être immédiatement placée dans un sac à déchets une fois la procédure terminée.
   3. Placez une entretoise propre de 0,4 mm le long des bords longs de la longue plaque de verre.
   4. Posez la plaque de verre courte sur la plaque longue et assurez-vous que les bords de la plaque courte, de la plaque longue et des entretoises sont alignés. Serrez chaque côté à l’aide de trois pinces métalliques régulièrement espacées.
   5. Ajouter 24 μL de TEMED à la solution d’acrylamide à 15 % et d’urée 8 M préparée à l’étape 3.1 et mélanger la solution.
   6. Ajouter 600 μL de APS à 10 % (p/v) à la solution à l’étape 1.2.5 et mélanger doucement la solution.
   7. Versez immédiatement la solution entre les plaques de verre.
      note: Pour éviter les bulles, tapotez le verre au fur et à mesure que la solution est versée.
   8. Ajoutez délicatement un peigne propre de 0,4 mm à 32 puits sur le dessus du sandwich en verre.
   9. Attendez un minimum de 30 min pour que l’acrylamide polymérise.
3. Exécutez le gel dénaturant
   1. Réglez le bloc de chaleur à 75 °C.
   2. Retirez les pinces métalliques qui maintiennent le sandwich de plaque de verre ensemble et lavez et séchez soigneusement le sandwich de plaque de verre.
   3. Placez le sandwich de plaque de verre dans l’appareil de gel avec la plaque courte vers l’intérieur.
   4. Préparez un tampon de fonctionnement 0,5x TBE en combinant 100 mL de 10x TBE avec 1,9 L d’eau sans RNase. Ajouter 600 mL de tampon de coulée dans les chambres supérieure et inférieure de l’appareil à gel.
   5. Retirez délicatement le peigne et rincez abondamment les puits à l’aide d’une seringue. REMARQUE : Cette étape est essentielle pour éliminer l’urée des puits.
   6. Pré-faites fonctionner le gel pendant 30 min à 50 W. La tension est d’environ 2 000 V. ATTENTION : Cet appareil au gel fonctionne à une puissance élevée et les utilisateurs doivent faire preuve de prudence.
   7. Rincez abondamment les puits à l’aide d’une seringue.
      note: Cette étape est essentielle pour un chargement uniforme de l’échantillon dans les puits.
   8. Rotation pulsée des réactions éteintes. Ensuite, incubez les tubes à 75 °C pendant 3 min. Répétez le spin d’impulsion.
   9. Chargez immédiatement 10 μL d’échantillon par puits et faites fonctionner le gel pendant 3 h à 50 W.
      note: L’ARN marqué par fluorescence est sensible à la lumière ; Par conséquent, couvrez l’appareil en gel avec du papier d’aluminium.
4. Imaginez le gel dénaturant.
   1. Coupez l’alimentation électrique et vidangez la chambre supérieure de l’appareil à gel.
   2. Lavez et séchez la face extérieure du sandwich en verre avec de l’eau et du savon. Couvrez le sandwich en verre avec du papier d’aluminium pendant le transport du gel.
   3. Montez le sandwich à plaque de verre sur la platine d’un scanner laser capable de détecter la fluorescence quantitative et sensible.
      note: Ce gel est extrêmement fin pour une résolution maximale. Pour cette raison, ce protocole est conçu pour éviter les difficultés liées au retrait du gel du sandwich de plaque de verre en visualisant directement l’ARN marqué par fluorescence à travers les plaques de verre. L’utilisation de plaques de verre à faible fluorescence disponibles dans le commerce augmentera le signal capturé en améliorant le rapport signal/bruit.
   4. Réglez les longueurs d’onde d’excitation et d’émission du scanner laser pour le fluorophore souhaité.
      note: Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission optimales peuvent différer pour des fluorophores spécifiques. Pour le fluorophore FAM, les longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont respectivement de 495 nm et 535 nm.
   5. Définissez la zone à visualiser sur la platine du scanner laser et imagez le gel selon les instructions du fabricant (Figure 1).

Résultats

Figure 1 : Exemple d’analyse de gel dénaturant de l’ARN phosphorylé. Dosage in vitro de l’ARN kinase de Las1-Grc3 (110 nM) incubé avec 500 nM d’ARN SC-ITS2. X marque la réaction de contrôle sans Las1-Grc3 et le triangle noir représente le titrage de l’AT...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Peigne 34 puits de 0,4 mm	BioRad	1653848
Entretoise de 0,4 mm	BioRad	1653812
0,5 M EDTA pH 8,0	KD Médical	RGF-3130
1M de chlorure de magnésium	KD Médical	CAC-5290
1M Tris pH 8.0	KD Médical	RGF-3360
Solution d’acrylamide/bis, 40 % 29:1	BioRad	1610146
Chlorure de sodium 5M	KD Médical	RGF-3720
persulfate d’ammonium (APS)	BioRad	Référence 161-0700
ATP	sigma	A2383-1G
acide borique	sigma	Réf. B0394
Sel de sodium bleu de bromophénol	sigma	B5525-5G
Plaques de verre	Thomas Scientific	Référence 1188K51
Séquenceur Hoefer SQ3	Hoefer	n/a
Image J Logiciel	n/a	n/a	https://imagej.nih.gov/ij/
Oligonucléotides d’ARN marqués	IDT	Commande personnalisée
Pharmacia EPS 3500 Alimentation	Pharmacie	n/a
Filtre Steriflip 0. 22 um	Millipore	Référence 5FCP00525
TEMED	BioRad	Référence 161-0800
Base Tris	sigma	TRIS-RO
Imageur gel Typhoon FLA 9500	GE Soins de santé	n/a
Eau DEPC ultra pure	Invitrogen	750023
Glycérol ultra pur	Invitrogen	Référence 19E1056865
urée	Fisher Chemical	U15-500

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