Électrophorèse bidimensionnelle semi-dénaturante sur gel d’agarose : une technique pour séparer les fibres amyloïdes polymorphes en fonction de l’hétérogénéité de taille

Résumé

Source : Hanna-Addams, S., et al. Utilisation de l’électrophorèse bidimensionnelle du gel d’agarose détergent semi-dénaturant pour confirmer l’hétérogénéité de taille des fibres amyloïdes ou de type amyloïde. J. Vis. Exp. (2018).

Cette vidéo montre la séparation par électrophorèse des fibres amyloïdes basée sur l’électrophorèse du gel d’agarose semi-dénaturant bidimensionnelle. La technique sépare les agrégats amyloïdes polymorphes en fonction de leur taille hétérogène.

Protocole

1. Préparer les échantillons

1. Cultivez 2 x 10⁶ cellules amyloïdes productrices de cancer du côlon HT-29 dans une boîte de culture tissulaire de 10 cm dans 10 mL de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) contenant 10 % de sérum fœtal bovin et de pénicilline-streptomycine. Cultivez des cellules pendant la nuit dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂.
   1. Une fois que les cellules ont atteint une confluence de 80 %, lavez-les avec 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Ajouter 3 mL de solution de trypsine et incuber à 37 °C pendant 3 min.
   2. Une fois que les cellules sont totalement dissociées de la boîte, ajoutez 10 ml de milieu de culture et transférez les cellules avec une pipette de 10 ml dans un tube conique de 15 ml. Centrifugez les cellules à 1 000 x g pendant 3 min à température ambiante. Aspirez le milieu, remettez les cellules en suspension dans 5 mL de milieu de culture et comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules. Assiette 2 x 10⁶ cellules dans chacune des deux boîtes de 10 cm.
   3. Laissez les cellules adhérer et récupérer pendant la nuit dans un incubateur à 37 °C avec 5 % de CO₂. Appliquer le traitement à une boîte pour induire la formation d’amyloïdes avec 20 ng/mL de facteur de nécrose tumorale-alpha (TNF-α), 100 nM de Smac-mimétique et 20 μM d’inhibiteur de pan-caspase Z-VAD-FMK. La combinaison est abrégée en TSZ. Traitez l’autre plat avec véhicule comme un contrôle.
2. Après la durée appropriée, généralement 6 h, récoltez le lysat cellulaire.
   1. Grattez les cellules de la plaque à l’aide d’un grattoir en plastique et utilisez une pipette de 10 ml pour transférer dans un tube conique de 15 ml. Centrifugez les cellules à 1 000 x g pendant 3 min à 4 °C.
   2. Laver les cellules 2 fois en les mettant en suspension dans 10 mL de PBS glacé et en les centrifugeant à 1 000 x g pendant 3 min à 4 °C. Aspirer la solution de PBS.
      note: Le processus peut être interrompu ici en congelant la pastille cellulaire dans de l’azote liquide et en la stockant à ˗80 °C jusqu’à 1 mois.
   3. Transférez la pastille cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et incubez dans 0,3 mL de tampon de lyse pendant 30 min sur de la glace. Centrifugeuse à 20 000 x g pendant 15 min à 4 °C. Le surnageant est le lysat cellulaire entier.
      note: Le processus peut être interrompu ici en stockant l’échantillon à -20 °C pendant plusieurs mois au maximum.
   4. Mesurez la concentration en protéines à l’aide d’un test Bradford. Ajouter 4 tampons de chargement SDD-AGE pour préparer 20 μL d’échantillon de 3 μg/μL et incuber à température ambiante pendant 10 min.

2. Préparer et exécuter les gels

1. Ajouter 2 g d’agarose à 200 ml de 1 tampon en tris-acétate (TAE) dans un bécher en verre et chauffer au micro-ondes pour faire fondre l’agarose. Ajouter 1 mL de SDS à 20 % pour une concentration finale de 0,1 % de SDS. Agiter délicatement pour mélanger. Attention à ne pas générer de bulles après l’ajout de la FDS.
2. Versez la solution d’agarose dans une plaque de gel de 15 cm x 14 cm. Utilisez une pipette de 1 ml pour éliminer les bulles. Placez un peigne de 20 puits en haut.
3. Première dimension : pipette de 60 μg de lysat de cellules entières dans la voie la plus à droite. Faites fonctionner le gel à 60 V pendant environ 4 h (jusqu’à ce que la face du colorant traverse environ 3/4 du gel) en utilisant le TAE contenant 0,1 % de SDS comme tampon de fonctionnement.
4. Deuxième dimension : tournez délicatement le gel de 90° dans le sens inverse des aiguilles d’une montre (Figure 1A). Faites fonctionner le gel à 60 V pendant environ 4 h
   note: La condition générale de fonctionnement est de 4 V/cm de longueur de gel. Il est important que les conditions de fonctionnement soient exactement les mêmes pour la première et la deuxième dimension.

Résultats

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Unité d’électrophorèse sur gel	pêcheur	HE99XPRO	Appratus pour la course au gel.
Agrose	VWR	Référence 97062-250	Pour le gel d’agarose.
DMEM	sigma	D6429	pour la culture cellulaire
sérum fœtal bovin	sigma	F4135	pour la culture cellulaire
Péniciline-streptomycine	sigma	Réf. P4333	pour la culture cellulaire
Solution de trypsine	sigma	Réf. T4049	pour la culture cellulaire
PBS pour la culture tissulaire	sigma	D8662	pour la culture cellulaire
TNF recombinant	Fabriqué dans notre laboratoire		pour induire la nécroptose. Voir référence 11.
SMAC-mimétique	don du Dr Xiaodong Wang		pour induire la nécroptose. Voir référence 11.
ZVAD-FMK	ApexBio	A1902	pour induire la nécroptose. Voir référence 11.
Compteur de cellules	Bio-Rad	1450102	Modèle TC20 ; pour le comptage des cellules
Kit de dosage des protéines Pierce™ BCA	Thermo Scientific	Référence 23225	pour mesurer la concentration en protéines dans les lysats cellulaires
Lève-cellules	pêcheur	Tél. : 07-200-364	Pour supprimer des cellules de la parabole
Tampon de lyse (1 L)			20 mL 1 M Tris pH 7,4 10 mL de glycérol 30 mL 5 M NaCl 840 mL jjH2O 10 mL Triton-X100 (inhibiteurs de la protéase et des phosphates au choix)
10X TAE (1 L)			48,4 g Tris base 11,42 mL d’acide acétique glacial 20 mL 0,5 M EDTA pH 8 jjH20 à 1 L
4X TAMPON DE CHARGEMENT SDD-AGE (50 ml)			5 ml 10X TAE 10 mL de glycérol 4 mL 20 % FDS 0,5 mL 10 % de bleu 31 mL de ddH2O
Tampon de lavage PBST (1 L)			100 mL 10xPBS 800 mL jjH2O 1 mL de Tween20
10 fois le PBS (10 L)			800 g de NaCl 20 g de KCl 144 g Na2HPO4·2H2O 24 g KH2PO4 ajouter jjH2O à 10 L