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1. Préparation des tissus
- Préparez 10 mL de 4 tampons d’échantillonnage BN-PAGE (200 mM de Bis(2-hydroxyéthyl)amino-tris(hydroxyméthyl)méthane (Bis-Tris), 200 mM de NaCl, 40 % p/v de glycérol, 0,004 % de Ponceau S, pH de 7,2).
note: Cette solution mère peut être préparée à l’avance et conservée à 4 °C.
- Diluer 250 μL de 4 tampons d’échantillon dans 750 μL dH2O contenant 1 cocktail d’inhibiteurs de protéase commerciaux. Vortex et froid sur glace.
- Homogénéisez 20 mg de tissu cible dans le tampon d’échantillon BN-PAGE glacé de 1 mL avec 30 coups d’un homogénéisateur de dénonciation propre.
note: Pour cette expérience de démonstration, le tissu cible est du tissu cérébral de rat entier. Après homogénéisation, les échantillons peuvent être traités avec un détergent doux tel que la digitonine à 2 % pour solubiliser et permettre l’électrophorèse des protéines membranaires.
- Transférez l’homogénat dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et centrifugez à 14 000 x g pendant 30 minutes jusqu’au contenu cellulaire insoluble des granules. Après la centrifugation, décantez le surnageant dans un tube propre sur de la glace.
- Suivez les instructions du fabricant pour mesurer la concentration en protéines surnageantes à l’aide de l’acide bicinchoninique (BCA) ou d’un test de quantification protéique similaire.
- Si l’échantillon d’homogénat contient un détergent, ajouter une quantité de 5 % de Coomassie Blue G-250 dans une solution aqueuse suffisante pour amener la solution d’homogénat à 0,25 % de Coomassie.
2. BN-PAGE
- Diluer 25 mL de matériau tampon d’électrophorèse 20x bleu natif (BN) (1,0 M Bis-Tris, 1,0 M tricine, pH 6,8) dans 475 mL dH2O contenant 0,002 % de bleu Coomassie pour obtenir 500 mL de 1x tampon courant.
- Si les échantillons contiennent du détergent, préparez plutôt 250 ml de 1 tampon courant contenant 0,02 % de Coomassie et 250 ml supplémentaires n’en contenant aucun.
- Réfrigérer le(s) tampon(s) à 4 °C.
- Nettoyez et assemblez une cassette de coulée de gel de polyacrylamide selon les instructions du fabricant.
- Versez le gel de polyacrylamide BN (couche d’empilement 3 % T, couche de résolution 6 % T) selon une recette standard et placez le peigne de puits.
- Une fois les gels polymérisés, rincez la cassette avec du dH2O et assemblez l’appareil d’électrophorèse selon les instructions du fabricant.
- Retirez le peigne de puits et remplissez les puits avec 1x tampon de coulée BN-PAGE. Évitez de remplir toute la chambre intérieure avec un tampon jusqu’à ce que les échantillons soient chargés.
- Si les échantillons contiennent du détergent, remplissez les puits avec le tampon contenant 0,02 % de Coomassie Blue.
REMARQUE : Effectuez les étapes 2.7-2.9 à 4 °C.
- À l’aide d’embouts de chargement de gel, pipeter un volume d’homogénat contenant 20 μg de protéines dans les puits souhaités. Pipetez un volume équivalent de 1 tampon d’échantillon BN-PAGE dans tous les wells.
inutilisés.
note: Utilisez la concentration en protéines déterminée à partir de l’analyse BCA pour calculer le volume approprié d’homogénat à ajouter dans les puits.
- Une fois les échantillons chargés, remplissez la chambre intérieure avec 1 tampon de fonctionnement BN-PAGE. Assurez-vous que le gel est entièrement immergé dans le tampon. Ensuite, remplissez la chambre extérieure avec 1x tampon de fonctionnement au niveau indiqué par le fabricant.
- Si les échantillons contiennent du détergent, remplissez la chambre intérieure avec le tampon 1x contenant 0,02 % de bleu Coomassie, et la chambre extérieure avec 1x tampon sans colorant.
- Connectez les électrodes à l’alimentation électrique et électrophorèse les protéines dans le gel à 150 V jusqu’à ce que la bande de colorant progresse de ~2 cm dans la couche de résolution. Arrêtez et débranchez l’alimentation électrique.
3. Réticulation
REMARQUE : Effectuez les étapes 3.1 à 3.6 à 4 °C.
- Démontez l’appareil d’électrophorèse et séparez les vitres de la cassette de gel. Retirez et jetez la couche d’empilement.
- Coupez soigneusement le gel juste en dessous du bord inférieur de la façade du colorant. Prenez soin de rendre cette coupe aussi lisse et droite que possible, puis jetez le morceau de gel non utilisé. Cela laissera une bande horizontale de ~2 cm de large de gel de polyacrylamide, qui contiendra toutes les protéines de l’échantillon d’homogénat.
- Coupez toutes les parties inutilisées le long des bords de la bande de gel.
- Placez délicatement la bandelette dans 10 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) dans un petit récipient, et mélangez doucement par nutation pendant 30 minutes pour équilibrer.
- Après l’équilibrage, jetez et remplacez le PBS par un autre 10 ml. Pipette 500 μL de DSP de 25 mM dissous dans du sulfoxyde de diméthyle dans le PBS, et continuer à mélanger comme ci-dessus (étape 3.4) pendant 30 min.
- Videz la solution DSP. Ajouter 10 ml de chlorhydrate de tris(hydroxyméthyl)aminométhane 0,375 M (Tris-HCl), pH 8,8, contenant 2 % de dodécylsulfate de sodium (SDS) pour éteindre le DSP n’ayant pas réagi. Poursuivre la nutation pendant 15 min.
4. PAGE-SDS
- Pendant que la bande de gel est en train de tremper, préparer les solutions de gel SDS-PAGE selon les méthodes standard. N’ajoutez pas de réactifs de polymérisation.
- Après la trempe, remettez la bande de gel βν à température ambiante et coulez-la dans une nouvelle cassette de gel.
- Pour ce faire, prélevez soigneusement le gel et placez-le sur une plaque d’espacement propre de la cassette de gel.
- Orientez la bande de manière à ce que le bas de la face avant du colorant soit le plus proche du haut d’une nouvelle cassette (c’est-à-dire que le côté qui a voyagé le plus loin pendant BN-PAGE doit être le plus proche du haut de la nouvelle cassette ; la bande de gel doit être retournée par rapport à son orientation précédente). Voir la figure 1.
- Placez la bande de manière à ce que son bord supérieur se trouve au même niveau que le bord supérieur de la plaque de recouvrement (c’est-à-dire qu’il sera au sommet du nouveau gel). Assurez-vous que la face avant du colorant est parallèle aux bords horizontaux de la plaque de verre.
- Poussez un côté de la bande excisée contre l’une des parois de l’espaceur, en laissant de la place de l’autre côté pour que le gel soit versé et qu’un étalon ou une échelle de protéines soit chargé.
- Si le bord inférieur de la bande de gel contient des zones déchiquetées ou inégales, coupez-les soigneusement. S’ils sont présents, ils emprisonneront les bulles lors du versement du gel.
- Une fois la bande de gel correctement positionnée, posez la plaque de recouvrement sur la plaque d’espacement. Appliquez une légère pression pour expulser les bulles d’air emprisonnées.
- Continuez à assembler l’appareil de versement de gel conformément aux instructions du fabricant.
- Ajoutez des réactifs de polymérisation dans le tampon de gel de résolution et versez-le dans la cassette de gel préparée, à l’aide d’une pipette sérologique. Remplissez la cassette de gel jusqu’à ~2 cm sous la bande de gel BN-PAGE excisée, pour laisser de la place pour la couche d’empilage.
- Ajoutez 100 μL de butanol sur le dessus du gel versé et attendez 30 min pour la polymérisation de la couche de résolution. Videz le butanol.
- Ajouter des réactifs de polymérisation à la solution de gel d’empilement. À l’aide d’une pipette sérologique, versez la couche d’empilement pour remplir tout l’espace vide restant dans la cassette de gel.
- Inclinez la cassette de gel pendant que la couche d’empilement est versée afin qu’elle remplisse l’espace sous la bande de gel et que les bulles d’air ne soient pas piégées.
- Au fur et à mesure que le tampon de gel empilable remplit l’espace vide sous la bande de gel, remettez progressivement la cassette de gel au niveau.
- Continuez à remplir l’espace vide à côté de la bande de gel excisée avec le tampon de gel empilable, jusqu’à ce qu’il déborde presque.
- Laisser la couche d’empilement polymériser pendant 30 min.
note: Préparez 10 tampons de coulée SDS-PAGE (250 mM de tris(hydroxyméthyl)aminométhane (tris), 1,9 M de glycine, 1 % de SDS) pendant que le gel polymérise. Celui-ci peut également être préparé à l’avance et conservé à température ambiante.
- Diluez 50 mL de 10x SDS-PAGE dans 450 mL dH2O pour obtenir 1x tampon de travail.
- Une fois la couche d’empilage polymérisée, retirez la cassette de gel de l’appareil de coulée, rincez avec du dH2O et assemblez l’appareil d’électrophorèse selon les instructions du fabricant.
- Remplissez complètement la chambre intérieure avec 1 tampon de fonctionnement SDS-PAGE, puis remplissez la chambre extérieure au niveau indiqué par le fabricant.
- Chargez l’espace à côté de la bande de gel excisée avec une échelle de poids moléculaire ou un étalon protéique approprié.
- Fixez les électrodes à l’alimentation électrique et électrophorisez les échantillons à 120 V. Lorsque le colorant Coomassie s’écoule du gel, arrêtez et débranchez l’alimentation électrique.
- Analysez le gel à l’aide de méthodes standard d’électrobuvardage et de détection des protéines par liaison aux anticorps.