Électrophorèse sur gel d’agarose d’amplicons d’ADN post-PCR : une méthode pour analyser les produits de la PCR multiplex et évaluer le succès de la réaction PCR

Résumé

Source : Gulla, S. et al. Analyse multi-locus à nombre variable Tandem-repeat de la bactérie pathogène pour les poissons Yersinia ruckeri par PCR multiplex et électrophorèse capillaire. J. Vis. Exp. (2019)

Dans cette vidéo, nous démontrons la séparation de l’ADN bactérien amplifié par PCR à l’aide de l’électrophorèse sur gel d’agarose. Le gel d’agarose fonctionne comme un tamis moléculaire, permettant à l’ADN chargé négativement de migrer en fonction de sa taille sous un champ électrique appliqué.

Protocole

1. Confirmation de l’amplicon PCR par électrophorèse sur gel

1. Selon les recommandations du fabricant, préparer un volume de gel d'agarose à 1,5 % (p/v) dans 1 tampon tris-borate-EDTA (TBE) adapté au nombre de réactions PCR à tester. Avant le plâtre, ajoutez 5 μL de colorant d’acide nucléique fluorescent pour 50 μL de solution de gel et mélangez. Utilisez des plateaux et des peignes appropriés pour le plâtre, en laissant un nombre approprié de puits libres pour les échelles de référence d’ADN.
2. Après le réglage, immergez le gel dans 1x tampon TBE dans un système GE. Mélanger 5 μL de produit PCR avec 2 μL de colorant de chargement et transférer dans des puits de gel. Ajoutez 5 μL d’échelle d’ADN dans des puits vides à titre de référence.
3. Faites fonctionner le gel à 110 V par 15 cm pendant environ 1 h et utilisez un système d’imagerie/visualisation de gel basé sur les UV pour vérifier la présence de plusieurs bandes (jusqu’à cinq) représentant des amplicons de PCR (voir l’exemple de la figure 1). Jetez le gel. Conservez les autres produits PCR à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient transformés.

Résultats

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agarose, universel, peqGOLD	VWR	732-2789P/732-2788
Tampon Tris-borate-EDTA (TBE)	Na	Na	Recette standard, produite sur place.
Colorant de chargement de gel d’ADN (6X)	Thermo Fisher Scientific	Réf. R0611
Système d’électrophorèse sur gel	Au choix	Na
Coloration à l’acide nucléique GelRed, 10 000 fois dans l’eau	Biotium	Réf. 41003	Colorant d’acide nucléique fluorescent
Échelle d’ADN GeneRuler 50 bp, prête à l’emploi	Thermo Fisher Scientific	Référence SM0373	Échelle d’ADN
Système d’imagerie/visualisation sur gel à base d’UV	Au choix	Na